МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ - Е. Л. Зайцева - 2015
ГЛАВА V. МЕТОДЫ ОКРАСКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Исследование бактерий в окрашенном препарате дает возможность изучить не только их морфологию, но и позволяет судить о некоторых деталях их химического строения. Это достигается с помощью специальных красок. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. У кислых красителей ион, придающий окраску (хромофор), - анион, у основных - катион.
К кислым красителям относятся эозин, кислый фуксин, эритрозин и др. Они интенсивно связываются с цитоплазматическими компонентами клетки.
Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциан фиолетовый, кристаллический фиолетовый, сафранин - активнее соединяются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерий делает ее более чувствительной к основным красителям. В микробиологической практике применяются только основные красители.
Интенсивность окрашивающей способности красителя зависит от pH среды: основные красители окрашивают объект тем интенсивнее, чем больше щелочи в среде, кислые - в более кислой. Различают простые и сложные (дифференциальные) способы окраски микроорганизмов.
ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ
Простая окраска позволяет обнаружить в микроскопируемом материале микробов, определить их количество, быстро изучить морфологические особенности микроорганизмов. Для этого применяют основные и нейтральные анилиновые красители. Для простой окраски используют только один краситель, чаще всего красного цвета - раствор фуксина (окраска 10-30 сек), фиолетового - генцианвиолет (окраска производится в течение 1-2 мин) или синего - метиленовый синий (окраска 3-5 мин). Препараты для окрашивания готовят на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,1-1,4 мм.
При окраске мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, предложенной А.И. Синевым. Для этого на высушенный и фиксированный препарат кладут красящую бумагу размером 2x4 см и наносят несколько капель воды. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу снимают пинцетом, мазок промывают водопроводной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.
Окраска разведенным фуксином.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) феноловый фуксин Циля;
3) вода;
4) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
5) спиртовка.
Техника окраски:
На приготовленный на предметном стекле, фиксированный на пламени и остывший исследуемый препарат наливают/наносят на фильтровальную бумагу на 10-30 секунд разведенный (1:10) феноловый фуксин Циля. Затем препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.
Окрашивание метиленовым синим. Способ метахроматического выявления волютиновых зерен у коринебактерий и скоплений нуклеиновых соединений у бактерий.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) водно-спиртовый раствор метиленового синего;
3) спиртовка;
4) пипетка или фильтровальная бумага с краской;
5) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка.
Техника окраски:
На приготовленный, высушенный и фиксированный мазок наливают пипеткой водно-спиртовой раствор метиленового синего на 3-5 минут, после чего препарат смывают водой, высушивают и микроскопируют.
Оценка результата. Протоплазма бактерий окрашивается в голубой цвет, волютиновые зерна - в темно-синий.
Окрашивание метиленовым синим по Леффлеру (метод Леффлера). Метиленовый синий относится к основным красителям, то есть хромофором является катион. Благодаря этому краситель интенсивно связывается с ядерными компонентами клеток за счет образования комплекса с анионами ДНК и рибосомальной РНК бактерий. Присутствие щелочи в растворе усиливает взаимодействие клеточных компонентов (ДНК и РНК) с хромофором.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) вода для промывания мазков;
3) ванночка и рельсы для окраски препаратов - мазков;
4) спирт этиловый 96% для фиксации мазков;
5) спиртовка;
6) бактериологическая петля;
7) раствор метиленового синего по Леффлеру.
Техника окраски:
1. Исследуемый материал наносят на чистые обезжиренные предметные стекла, растирают его тонким равномерным слоем по поверхности стекла, высушивают на воздухе.
2. Препарат фиксируют 3 мин в 96% этиловом спирте и высушивают.
3. На высушенный препарат наносят каплю 1% щелочного раствора метиленового синего по Леффлеру и окрашивают в течение 3-10 минут.
3. Промывают погружением в стакан с водопроводной водой.
4. Высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой.
Оценка результата. При правильном окрашивании в микроско- пируемом препарате видны голубые бактерии на бесцветном или слабо голубом фоне.
СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ
На препарат последовательно наносят определенные красители, различающиеся по химическому составу, цвету, протравы, спирты, кислоту и т. д.
Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать один вид микроорганизмов от других.
Метод окраски по Граму. Метод разработал в 19 веке датский бактериолог Ханс Христиан Грам (Gram, 1884). Предлагая в 1884 г. свой метод окраски бактерий в срезах и препаратах - отпечатках из органов, он не оценил крупнейшего дифференциально-диагностического значения этого метода, хотя указывал, что некоторые микроорганизмы, например, брюшнотифозная палочка, обесцвечиваются и окрашиваются в дополнительный цвет. Впервые на значение окраски по Граму для дифференцирования бактерий указал в 1886 г. Э. Ру.
Принцип метода. Восприимчивость к окраске по Граму определяется толщиной клеточной стенки и ее химической структурой. Клеточная стенка грамположительных бактерий представляет собой многослойный пептидогликан толщиной 20-60 нм. Микрофибриллы пептидогликана, переплетаясь между собой, образуют густую сеть, пронизанную порами. С пептидогликаном клеточной стенки ковалентно связаны тейховые и липотейховые кислоты, выступающие на поверхность клетки через поры пептидогликанового каркаса.
У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. Кроме того, у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, отсутствующая у грамотрицательных. Она и образует прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных бактерий такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта. Фуксин докрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет. Кроме того, структура пор пептидогликана грамположительных бактерий такова, что препятствует вымыванию красителя при обработке мазка бактерий спиртом.
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий содержит 1-2 слоя пептидогликана, толщина ее намного меньше (10-20 нм), чем у грамположительных микроорганизмов. В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная бимолекулярным слоем липидов поверхностного слоя пептидогликана. Наружная мембрана имеет мозаичную структуру, состоящую из молекул фосфолипидов, полисахаридов и белков. Белки наружной мембраны - «порины» - окружают гидрофильные поры, через которые проходят водные и другие молекулы массой до 800 Да.
Грамотрицательные бактерии при обработке препарата спиртом вследствие недостаточного количества пептидогликанов в клеточной
стенке утрачивают комплекс йода с кристаллическим фиолетовым, обесцвечиваются и затем приобретают контрастный цвет дополнительными красителями.
Часть клетки, вступающая в тройное соединение с красителем и протравой, - магниевая соль рибонуклеиновой кислоты. При обработке взвеси грамположительных микробных клеток солями желчных кислот рибонуклеат магния извлекается, и клетка становится грамотрицательной. Прибавление к таким грамотрицательным клеткам извлеченного рибонуклеата магния возвращает им грамположительность.
Особенности приготовления препарата для окраски по Граму. В настоящее время в процессе приготовления препаратов для окраски по методу Грама обычно игнорируют все те методические детали, которым прежде придавали немаловажное значение. Такое пренебрежение во многих случаях приводит к нечетким и даже ошибочным результатам.
Концентрация бактерий. Для получения достоверных результатов окраски препарат должен быть тоньше. В густых мазках, в которых клетки находятся в скоплениях («кучках»), часто выпадает осадок красителя, и труднее осуществляется обесцвечивание грамотрицательных организмов. Наоборот, грамположительные организмы в местах скоплений обесцвечиваются значительно скорее, чем одиночно расположенные клетки. Бактерии в препарате должны находиться на возможно большем расстоянии одна от другой.
Подсушивание препарата. Выше было сказано, что положительная окраска по Граму связана с наличием в клетке рибонуклеата магния. Извлечение этого соединения лишает клетку ее грамположительности. К числу экстрагентов, обладающих способностью извлекать нуклеиновые кислоты и их соли из клетки, относится и физиологический раствор. Приготовление взвеси бактерий из культур на плотных средах в физиологическом растворе и длительное подсушивание могут привести к частичному извлечению из клеток рибонуклеата магния и частичному превращению их в грамотрицательные. Длительное хранение взвеси бактерий в физиологическом растворе, дистиллированной воде частично или полностью превращают грамположительные клетки в грамотрицательные. Даже длительное подсушивание на стекле капли взвеси, приготовленной в физиологическом растворе, может привести к частичной утрате способности сопротивляться обесцвечиванию. Поэтому следует наносить на стекло минимальное количество жидкой культуры или взвеси клеток из плотной культуры петлей, распределять как можно более тонким слоем с целью максимального ускорения высыхания мазка. Быстрое подсушивание нагреванием на пламени не рекомендуется, так как это способствует извлечению рибонуклеата магния из клетки.
Распределение взвеси на стекле. Травмирование клеток грамположительных бактерий может привести к утрате их способности противостоять обесцвечиванию. Слишком энергичное растирание петлей взвеси на стекле при приготовлении мазка может привести к частичному изменению отношения к окраске по Граму.
Фиксация. Фиксировать препарат для окраски по Граму можно только на пламени горелки/спиртовки. Применение прочих методов фиксации, в частности метиловым спиртом, смесью этилового спирта с эфиром и др., может дать искаженную картину. Однако при фиксации жаром интенсивность нагревания мазка и интенсивность обесцвечивания грамположительных бактерий находится в прямой зависимости - чем больше грамположительные клетки подвергаются тепловому воздействию, тем больше обнаруживается среди них грамотрицательных особей. Поэтому фиксация на пламени горелки должна быть осторожной и щадящей.
Процедура окрашивания препарата должна быть начата лишь после того, как он полностью охладился. Не рекомендуется наливать раствор красителя на еще горячий после фиксации препарат.
Факторы, влияющие на результаты окраски по Граму. Воздействием на культуру различных веществ, культивированием в средах с примесью этих веществ можно добиться превращения грамотрицательных микробов в грамположительные и обратно.
Помимо создания таких необычных условий существования, и в физиологических условиях могут иметь место колебания в отношении к окраске по Граму. У каждого бактериального вида есть определенный максимальный возраст культуры, в котором наиболее четко выражено характерное отношение данного вида к окраске по Граму. Молодые культуры грамположительных бактерий более устойчивы к обесцвечиванию, чем старые, хотя есть указания, что 48-часовые культуры более устойчивы, чем 24-часовые. В самых ответственных случаях, особенно при определении отношения к окраске по Граму вновь описываемого микроба, рекомендуется готовить препараты для окраски по Граму из культур трех возрастов - 6-8-часовых, 12-24-часовых и 48-часовых.
Даже место на поверхности скошенного агара может влиять на результаты окраски по Граму. Препарат, приготовленный из газона, снятого с верхнего, уже подсыхающего участка агара, может дать совершенно иные результаты, чем приготовленный из нижней, более влажной части агара.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллического фиолетового (1 г красителя, 10 мл спирта 96%, 2 г кристаллической карболовой кислоты, 100 мл дистиллированной воды или 10 мл 4% спиртового раствора красителя и 100 мл 2% карболовой кислоты);
3) раствор Люголя (в модификации Грама): 2 г йодида калия, 10 мл дистиллированной воды, 1 г кристаллического йода. Смесь настаивается сутки, после чего добавляют 300 мл дистиллированной воды;
4) 96% этиловый спирт;
5) водный раствор фуксина;
6) вода для промывания препарата;
7) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
8) спиртовка.
Техника окраски:
1. Фиксированный мазок окрашивают карболовым раствором генцианового фиолетового в течение 1-2 минут.
2. Сливают остаток краски, непромывая препарат водой, наливают раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата.
3. Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96% спиртом (препарат несколько раз помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек). Обесцвечивание проводят не более 20-30 сек.
4. Препарат промывают водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина 1-2 минуты.
6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.
Оценка результатов. Грамположительные бактерии окрашены в темно-фиолетовый или синий цвет, грамотрицательные - в красный или розовый.
Окраска по Граму в модификации А.И. Синева. Для окраски применяются кусочки фильтровальной бумаги, пропитанные 1% спиртовым раствором кристаллического фиолетового и высушенные. Для этого на листы фильтровальной бумаги, разложенные на стекле, наливают 1-2% раствор (в 96% этиловом спирте) краски и затем окрашенную высушенную бумагу разрезают на кусочки размером 2x4 см и сохраняют в стеклянных темных банках с притертой пробкой. Подготовленные таким способом бумажки не теряют окрашивающих свойств весьма продолжительное время.
Техника окраски:
1. На фиксированный препарат кладут полоску (квадрат) фильтровальной бумаги, пропитанную 1% спиртовым раствором кристаллического фиолетового.
2. Наливают несколько капель воды, окрашивают 1-2 минуты.
3. Снимают полоску фильтровальной бумаги.
4. Наливают на препарат раствор Люголя на 1 мин (до почернения краски).
5. Сливают раствор Люголя.
6. Прополаскивают мазок в 96% спирте 30 сек.-1 мин (до отхождения красителя.
7. Промывают водой.
8. Обесцвеченные элементы и клетки дополнительно окрашивают разведенным фуксином Пфейффера, нанесенным на фильтровальную бумагу, смоченную водой, и прижав ее к мазку, выдерживают 30 с - 1 мин.
9. После окраски препарат тщательно промывают водой и высушивают.
10. Микроскопируют с иммерсионной системой.
Оценка результатов. При микроскопии грамположительные бактерии - сине-фиолетового цвета, грамотрицательные - розово-красные.
Окраска по Граму в модификации К.Н. Аткинса. (Atkins K.N., 1920). Данный метод используют для улучшения окраски грамположительных бактерий, однако, состав красителей несколько отличается. Мазки, окрашиваемые по Аткинсу, более устойчивы к обесцвечиванию, так как фиксирующий раствор гораздо прочнее удерживает генцианвиолет. Это особенно важно для бактерий с повышенной чувствительностью к обесцвечиванию (Streptococcus pneumoniae, Bacillus spp.).
Спиртовой раствор генцианвиолета:
✵ Кристаллический генцианфиолетовый (85 - 90%-й) - 20 г;
✵ Спирт этиловый 96%-й - 200 мл;
✵ Аммония оксалат [(NH4JC2O4] - 8 г;
✵ Дистиллированная вода - 800 мл.
Растворить кристаллвиолет, растирая в ступке с добавлением спирта, а оксалат - в воде; смешать оба раствора и через сутки профильтровать готовый краситель.
Йодный раствор:
✵ Йод кристаллический (I2) - 20 г;
✵ Натрия гидроокись (I N раствор) - 100 мл;
✵ Дистиллированная вода - 900 мл.
Растворить йод в щелочи, добавить воду. Хранить при комнатной температуре в емкости из темного стекла. Для обесцвечивания используют чистый ацетон.
Раствор сафранина:
✵ Сафранин В (2,5%-й раствор в 95%-м этиловом спирте) - 25 мл;
✵ Вода дистиллированная - 75 мл.
Вначале готовят 2,5%-й спиртовой раствор сафранина, затем смешивают его в указанной пропорции с водой.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) спиртовый раствор генцианового фиолетового;
3) йодный раствор;
4) чистый ацетон;
5) раствор сафранина;
6) вода для промывания препарата;
7) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
8) спиртовка.
Техника окраски:
1. Фиксированный мазок окрашивают спиртовым раствором генцианового фиолетового в течение 1-2 минут.
2. Сливают остаток краски, не промывая препарат водой, наливают йодный раствор на 1-2 минуты до почернения препарата.
3. Сливают йодный раствор, окрашенный мазок обесцвечивают чистым ацетоном (препарат несколько раз помещают в стакан с ацетоном). Обесцвечивание длится не более 20-30 секунд.
4. Препарат промывают водой.
5. Докрашивают мазок раствором сафранина 1-2 минуты.
6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.
Метод Аткинса не дает преимуществ при окрашивании грамотрицательных микроорганизмов, более того, выявление таких микроорганизмов может быть осложнено в некоторых материалах, например, мазках крови.
Окраска по методу Г.П. Калины. Профессор Г.П. Калина предложил специально для микроорганизмов группы нейссерий щадящий метод окраски, т. к. при окрашивании по Граму они неравномерно обесцвечиваются спиртом.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) реактив Г.П. Калины;
3) 0,5% раствор бриллиантового зеленого;
4) физиологический раствор хлорида натрия;
5) вода для промывания препарата;
6) 5-10% водный раствор фуксина;
7) 30% этиловый спирт;
8) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
9) спиртовка.
Техника окраски:
1. В небольшой капле физиологического раствора на предметном стекле суспендируют исследуемую культуру.
2. Суспензию смешивают с одной каплей 0,5% спиртового раствора бриллиантового зеленого, распределяют мазок равномерно тонким слоем.
3. Подсушивают и фиксируют над пламенем спиртовки.
4. На фиксированный мазок наносят реактив Калины на 1,5-2 мин.
5. Краску сливают и промывают водой, а затем 30% этиловым спиртом до отхождения красителя.
6. Снова промывают водой.
7. Докрашивают препарат 10% водным раствором фуксина в течение 2 мин.
8. Мазок промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Оценка результатов. При микроскопии грамположительные бактерии - зелено-черного или фиолетового цвета, грамотрицательные - розово-красные.
Метод окраски по Романовскому-Гимзе. Универсальный цитологический метод окраски простейших, бактерий, риккетсий, хламидий, спирохет, клеточных структур и тканей различных видов (в том числе крови) при световой микроскопии. Предложен в 1904 году Густавом Гимзой (Gimsa).
Сущность метода. В авторской версии название красителя - «Giemsasche Lözung für die Romanowsky färbung» (Раствор Гимзы для окраски по Романовскому). Краситель Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура, благодаря чему он окрашивает в разные цвета элементы микроорганизмов и форменные элементы крови.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) дистиллированная вода;
3) метиловый спирт или 95% этиловый спирт для фиксации мазков;
4) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
5) спиртовка;
6) стандартный раствор красителя Романовского-Гимзы.
Техника окраски:
1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте в течение 3 мин, высушивают на воздухе и окрашивают раствором красителя, который готовят непосредственно перед использованием (к 10 мл дистиллированной воды прибавляют 10 капель красителя Романовского-Гимзы, коммерческого).
2. Через час краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе, исследуют при иммерсии.
Оценка результата. Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток - в голубовато-синий, ядра - в фиолетово-красный.
При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра - красно-фиолетовый.
Окраска по методу Здродовского. Цитологический метод окраски риккетсий, предложенный Здродовским.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) дистиллированная вода;
3) разведенный фуксин Циля (в 10 мл дистиллированной воды добавить 10-15 капель фуксина Циля);
4) 0,5% раствор лимонной кислоты или 0,01% раствор хлороводородной кислоты;
5) метиленовый синий;
6) бактериологическая петля;
7) спиртовка.
Техника окраски:
1. Окрасить мазок разведенным фуксином Циля (10-15 капель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 минут.
2. Промыть водой.
3. Обработать мазок 0,5% раствором лимонной кислоты или 0,01% раствором хлороводородной кислоты.
4. Промыть водой.
5. Окрасить метиленовым синим в течение 1 мин.
6. Промыть водой и высушить препарат.
7. Микроскопировать с иммерсией.
Оценка результата. Риккетсии - красного цвета, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют - голубые, ядра - синие.
Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов. Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бактерий в щелочной среде (3% растворе КОН) и определении свободной ДНК. Образующаяся слизь свидетельствует о том, что КОН разрушает бактериальную клеточную стенку, и ДНК остается свободной (слизистое образование).
Материалы:
1) предметное стекло;
2) 3% раствор КОН;
3) бактериологическая петля;
4) спиртовка.
Техника окраски:
1. На предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора КОН и 1 петлю 24-часовой исследуемой агаровой культуры, тщательно перемешивают.
2. Через 5-10 с медленно приподнимают бактериологическую петлю на высоту 2-3 см.
Оценка результата. Грамотрицательные культуры через 5-7 с при движении петли вверх образуют слизистый след длиной 1-2 см; если слизь не образовывается, то тестируемая культура грамположительная.
ОКРАСКА КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ БАКТЕРИЙ
Окраска по методу Циля-Нильсена. Впервые метод выявления кислотоустойчивых бактерий был предложен в 1882-1883 гг. немецкими медиками Францем Цилем и Фредериком Нильсеном и предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза, лепры, некоторых актиномицетов, покоящиеся эндоспоры) от некислотоустойчивых.
Сущность метода. Клеточная стенка и цитоплазма кислотоустойчивых бактерий отличаются высоким содержанием липидов, воска и оксикислот с 50-100 атомами, которые делают клеточную стенку непроницаемой для кристаллвиолета и других красителей. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведенными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов применяют более концентрированные растворы красок в подогретом состоянии, добавляют в них детергенты и удлиняют сроки окраски. После того как краска введена в клетку, ее нельзя обесцветить обычными кислотными и спиртовыми растворителями.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) карболовый фуксин Циля;
3) 5% раствор серной кислоты (H2SO4);
4) вода для промывания препарата;
5) водный раствор метиленового синего (раствор Леффлера);
6) 95% этиловый спирт;
7) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
8) спиртовка.
Техника окраски:
1. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, непревышающий по размеру предметное стекло.
2. Наливают карболовый фуксин Циля (основной краситель) и осторожно нагревают мазок на горелке/спиртовке 3-5 минут до появления паров, после чего оставляют краситель, пока препарат несколько остынет.
3. Снимают бумагу с фуксином и промывают препарат водой.
4. Окрашенный препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) 3-5 с или смесью: 10 частей спирта и 1 части соляной кислоты в течение 1-2 мин, или 96% этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты (НС1), несколько раз погружая предметное стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом, пока мазок на вид не станет бледно-розовым.
5. Препарат тщательно промывают водой.
6. Споласкивают его 96% этиловым спиртом (в лаборатории часто этот этап упускают).
7. Снова ополаскивают водой.
8. Докрашивают 3-5 мин водным раствором метиленового синего Леффлера (дополнительный краситель).
9. Препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.
Оценка результатов. Кислотоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в рубиново-красный цвет, некислотоустойчивые - в синеголубой.
Удобно пользоваться модификацией А.И. Синева: фильтровальную бумагу пропитывают спиртовым раствором краски (2% спиртовым раствором фуксина), затем сушат, нарезают на полоски по размеру предметного стекла и хранят впрок. На фиксированный препарат наносят несколько капель дистиллированной воды, накладывают окрашенную бумажку, нагревают до отхождения паров и далее поступают, как в предыдущем способе, начиная с конца первого пункта.
Окраска препарата из мочи по Циль-Нильсену в модификации Хузе. В моче, наряду с кислотоустойчивым M. tuberculosis, могут встречаться кислотоустойчивые бактерии половой смазки - M. smagmatis, отличающиеся от первых спиртоподатливостью. Хузе предложил использовать этот признак для их дифференциации. Модификация Хузе повторяет метод Циля-Нильсена, но после обработки мазка холодной 5% H2S04 и промывки водой, дополняется обработкой этанолом (20 с).
Материалы:
1) предметное стекло;
2) карболовый фуксин Циля;
3) 5% раствор серной кислоты;
4) вода для промывания препарата;
5) раствор метиленового синего Леффлера;
6) 95% этиловый спирт;
7) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
8) спиртовка.
Техника окраски:
1. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 минут или окрашенной фуксином бумагой до появления паров, но, не доводя краситель до кипения.
2. Препарат остудить, снять бумагу, слить краситель и промыть водой.
3. Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин.
3. Остаток кислоты слить, препарат промыть водой и обработать этанолом 20 с.
4. Докрашивают 3-5 мин водным раствором метиленового синего Леффлера (дополнительный краситель).
5. Препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.
Оценка результатов. M.tuberculosis к этанолу устойчивы и не обесцвечиваются, оставаясь красными. M. smagmatis под влиянием спирта эту краску теряют, но при докраске метиленовой синью становятся синими.
Окраска по Бунге-Траутенроту. Этот метод применяется для окрашивания осадка мочи при дифференциации M. tuberculosis и M. smagmatis.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) абсолютный спирт;
3) карболовый фуксин;
4) 1N хромовая кислота (H2CrO4);
5) 10% раствор серной кислоты;
6) вода для промывания препарата;
7) насыщенный раствор метиленового синего;
8) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка
9) спиртовка.
Техника окраски:
1. Стекло с нанесенным на него мазком погружают в абсолютный спирт на 3 ч для извлечения жирных кислот.
2. Затем на 15 мин погружают в хромовую кислоту.
3. Промывают препарат водой.
4. Окрашивают при подогревании карболовым фуксином.
5. В течение 3 мин обесцвечивают 10% серной кислотой.
6. Докрашивают 5 мин насыщенным спиртовым раствором метиленового синего.
Оценка результата. Кислотоустойчивые бактерии М. tuberculosis - малинового цвета, менее кислотоустойчивые M. smagmatis - синего цвета.
Окраска по Семеновичу-Марциновскому. Этот метод окраски предназначен для кислото- и спиртоустойчивых микроорганизмов.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) карболовый фуксин Циля;
3) раствор метиленового синего Леффлера;
4) вода для промывания препарата;
5) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
6) спиртовка.
Техника окраски:
1. Мазок окрашивают разведенным (1:3) карболовым фуксином Циля в течение 2 мин.
2. Препарат промывают водой.
3. Красят раствором метиленового синего Леффлера 3-5 мин.
4. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Оценка результата. Кислото- и спиртоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в красный цвет, все остальные микробы - в синий.
Окраска по Баумгартену. Этот метод применяется для отличия лепрозных палочек (М. leprae) от М. tuberculosis.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) насыщенный спиртовый раствор фуксина;
3) 95% этиловый спирт;
4) дистиллированная вода;
5) хлористоводородная кислота (НС1);
6) разведенный метиленовый синий;
7) вода для промывания препарата;
8) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
9) спиртовка.
Техника окраски:
1. Мазок окрашивают в растворе фуксина (5 капель насыщенного спиртового раствора фуксина и 5 мл дистиллированной воды) без подогревания в течение 5-7 мин.
2. Затем обесцвечивают в смеси 10 частей спирта и 1 части хлористоводородной кислоты 15 с.
3. Препарат промывают водой.
4. Докрашивают разведенным метиленовым синим.
5. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Оценка результата: M. leprae окрашиваются в розово-красный цвет, М. tuberculosis - в синий.
Окраска по Муху. Метод применяется для выявления зернистой формы туберкулезных микобактерий (зерна Муха).
Материалы:
1) предметное стекло;
2) насыщенный спиртовый раствор метилового фиолетового;
3) 2% водный раствор карболовой кислоты;
4) раствор Люголя;
5) 5% раствор азотной кислоты;
6) 3% раствор хлористоводородной кислоты;
7) 95% раствор этилового спирта;
8) ацетон;
9) фуксин Пфейффера;
10) вода для промывания препарата;
11) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
12) спиртовка.
Техника окраски:
1. Препарат выдерживают 24 ч в смеси 10 мл насыщенного спиртового раствора метилового фиолетового и 100 мл 2% водного раствора карболовой кислоты.
2. Затем обрабатывают раствором Люголя в течение 1-2 мин.
3. Сливают раствор Люголя и наносят на препарат 5% раствор азотной кислоты на 1 мин.
4. Далее, на 10 с наносят 3% раствор хлористоводородной кислоты.
5. Сливают раствор и помещают в смесь, состоящую из равных объемов спирта и ацетона.
6. Промывают препарат водой и докрашивают фуксином Пфейффера.
7. Промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют.
Оценка результата. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.
Окраска зернистых форм M. tuberculosis по методу Козлова.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) смесь Козлова;
3) раствор Люголя;
4) 0,1% раствор сафранина;
5) вода для промывания препарата;
6) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
7) спиртовка.
Техника окраски:
1. Фиксированный мазок погружают в склянку со смесью Козлова на 45 мин.
2. Мазок промывают водопроводной водой.
3. Наносят на препарат раствор Люголя на 20 сек.
4. Промывают водопроводной водой 2-3 сек.
5. Докрашивают 0,1% раствором сафранина 1-2 мин.
6. Промывают препарат водопроводной водой, высушивают и микроскопируют.
Оценка результатов. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, остальные микроорганизмы - малиново-красные. В M. tuberculosis определяется выраженная зернистость.
ВЫЯВЛЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
При обычных способах окраски выявить клеточную стенку микроорганизмов невозможно. Определение клеточной стенки микроорганизмов, окрашенной по Граму или Цилю-Нильсену, не предполагает разграничение ее с телом бактерий. Для ее контрастирования мазок нуждается в специальной обработке, предшествующей окрашиванию. Препарат готовят из сильно разбавленной микробной взвеси, чтобы между микробными телами было свободное пространство.
Окраска по способу Гутштейна.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) жидкость Буэна;
3) 10% раствор танина;
4) вода;
5) 0,02% спиртово-водный раствор кристаллического фиолетового;
6) бактериологическая петля;
7) спиртовка.
Техника окраски:
1. Приготовленный препарат высушивают на воздухе.
2. Фиксируют в жидкости Буэна 3 мин.
3. Протравливают 25 мин 10% (вес/объем) водным раствором танина.
4. Промывают водопроводной водой.
5. Окрашивают 0,02% спиртово-водным раствором кристаллического фиолетового 30-60 сек.
6. Остаток краски сливают и препарат, не промывая водой, высушивают и микроскопируют.
Оценка результатов. Клеточные стенки имеют вид длинных тонких нитей темно-фиолетового или черного цвета, очерчивающих тела клеток с белой или светло-голубой цитоплазмой.
ВЫЯВЛЕНИЕ ОБОЛОЧКИ
Окраска по Пешкову.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) 25% раствор NaСl;
3) 10% раствор танина;
4) вода для промывания мазков;
5) фуксин Пфейффера;
6) бактериологическая петля;
7) спиртовка.
Техника окраски:
1. 1-2 петли дрожжей внести в 1-2 мл (гипертонический раствор для извлечения воды из клеток) - 30-40 минут.
2. Приготовить мазок, высушить, зафиксировать на пламени спиртовки или в спирт-формоле.
3. На фиксированный препарат налить 10% раствор танина (протрава).
4. Сливают танин, осторожно промывают водой.
5. Окрашивают препарат фуксином Пфейффера.
6. Препарат тщательно промывают водой и высушивают, микроскопируют с иммерсией.
Оценка результатов: бактерии красного цвета.
ОКРАСКА СПОР БАКТЕРИЙ
Формирование спор связано с уплотнением и обособлением определенного участка цитоплазмы вегетативной клетки с последующим образованием внутри бактерии круглого или овального тельца, покрытого плотной многослойной оболочкой, которая пропитана большим количеством липидов, кальция, дипиколиновой кислоты. Плотная оболочка спор, непроницаемая для воды, окрашивается с большим трудом, поэтому при обычных методах окраски споры имеют вид неокрашенных пустот внутри клетки.
После полного созревания споры вегетативная часть клетки может лизироваться. Среди патогенных микробов способностью к спорообразованию обладают только палочковидные грамположительные бактерии.
Окраску спор производят специальным методом, который включает предварительное прогревание споры, а также применение протрав (кислоты или щелочи). Протравы разрыхляют оболочку споры, облегчая проникновение в нее красителя. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью, в отличие от вегетативного тела микробной клетки, обесцвечивающегося под действием кислоты.
Окраска по методу Ожешко. Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. После протравы соляной кислотой при нагревании в течение 2-3 мин мазок фиксируется и окрашивается по методу Циля-Нильсена: препарат окрашивают основным красителем, затем обесцвечивают кислотой и докрашивают дополнительно в контрастный цвет. Споры прочно удерживают карболовый фуксин и окрашиваются в красный цвет, цитоплазма бактерий обесцвечивается 5% серной кислотой и после докрашивания метиленовым синим, приобретает синий цвет.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) 0,5% раствор хлористоводородной кислоты;
3) вода для промывания мазков;
4) карболовый фуксин Циля;
5) 5% раствор серной кислоты;
6) метиленовый синий;
7) бактериологическая петля;
8) спиртовка.
Техника окраски:
1. На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной кислоты (НСl) и подогревают 1-2 мин над пламенем горелки/спиртовки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.
2. Препарат (остывший) промывают водой, подсушивают и фиксируют над пламенем горелки/спиртовки.
3. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании до появления паров.
4. Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение нескольких секунд.
5. Промывают водой.
6. Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим Леффлера (дополнительный краситель), высушивают и микроскопируют с иммерсией.
Оценка результатов. Споры бактерий окрашиваются в красный цвет, цитоплазма приобретает синий цвет, вегетативные тела микробных клеток становятся голубого цвета.
Окраска по методу Пешкова. М. А. Пешков предложил окрашивать споры метиленовым синим Леффлера, причем для изменения устойчивости оболочки он применил кипячение. Споры и цитоплазма окрашиваются при нагревании. Промывание препарата водой ведет к обесцвечиванию цитоплазмы, тогда как спора прочно удерживает краситель.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) метиленовый синий Леффлера;
3) вода для промывания мазков;
4) 0,5% водный раствор нейтрального красного;
5) бактериологическая петля;
6) спиртовка.
Техника окраски:
1. Приготовленный мазок фиксируют над пламенем спиртовки.
2. На фиксированный мазок наливают метиленовый синий Леффлера и кипятят над пламенем спиртовой горелки 20-30 секунд.
3. Остывший препарат промывают водой и докрашивают 0,5% раствором нейтрального красного в течение 30-60 секунд.
4. Опять промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
5. Микроскопируют с иммерсией.
Оценка результатов. Споры окрашиваются в голубой или в синий цвет. Протоплазма вегетативного тела бактерий - розовая или красная.
Окраска по методу Шеффера и Фултона.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) 5% водный раствор малахитового зеленого;
3) вода для промывания мазков;
4) 0,5% раствор сафранина;
5) бактериологическая петля;
6) спиртовка.
Техника окраски:
1. На фиксированный мазок нанести 5% водный раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагреть до появления паров (3-6 мин).
2. Промыть водой.
3. Докрасить 0,5% водным раствором сафранина в течение 30 с.
4. Промыть водой и высушить препарат на воздухе.
5. Микроскопировать с иммерсией.
Оценка результатов. Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, вегетативные клетки - в красный.
Окраска по методу Вертца-Канклина.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) 5% водный раствор малахитового зеленого;
3) вода для промывания мазков;
4) 0,5% водный раствор сафранина;
5) бактериологическая петля;
6) спиртовка.
Техника окраски:
1. Препарат фиксируют над пламенем спиртовки.
2. Фиксированный мазок окрашивают 5%-м водным раствором малахитового зеленого, 3-4 раза нагревая его до появления паров (3-6 мин).
3. Промывают мазок водой.
4. Докрашивают препарат 0,5%-м водным раствором сафранина.
Оценка результатов. Тело бактерий окрашивается в красный цвет, споры - в зеленый.
Метод выявления спор негативным окрашиванием применяется при количественной оценке процесса спорообразования путем подсчета количества спор и вегетативных клеток в разных условиях роста бактерий.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) метиленовый синий или фуксин;
3) бактериологическая петля;
4) спиртовка.
Техника окраски:
1. На предметном стекле готовят тонкий мазок клеток спорулирующих бактерий, подсушивают на воздухе и фиксируют в пламени.
2. Затем на 3-5 мин наносят метиленовый синий или на 1-3 мин фуксин.
3. Препарат осторожно просушивают на воздухе.
4. Просматривают с иммерсией.
Оценка результатов. Вегетативные клетки бактерий прокрашиваются, а споры, имеющие многослойную, труднопроницаемую оболочку - нет. Они видны как сферические или овальные образования, находящиеся в зависимости от стадии спорообразования внутри или вне клеток бактерий.
СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ КАПСУЛ МИКРООРГАНИЗМОВ
Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое, концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Химический состав капсул у разных бактерий неодинаков, поэтому их нельзя выявить каким-либо одним методом окраски. Кроме того, капсулы при окраске легко деформируются, а вещество капсулы слабо связывает краситель, который легко отмывается в процессе обработки препарата. При обычных методах окраски капсулы остаются бесцветными. Это позволяет применять простые методы окраски для выявления капсульных микроорганизмов в мазках из органов и тканевой жидкости. Для окрашивания вещества капсул применяются специальные методы окраски.
Метод окарски по Дюгиду. Самый простой и наиболее эффективный метод окраски капсул.
Материалы:
1) предметное и покровное стекла;
2) тушь;
3) фильтровальная/промокательная бумага;
4) бактериологическая петля;
5) спиртовка.
Техника окраски:
1. На чистое предметное стекло петлей нанести тушь и смешать ее с культурой.
2. На часть полученной бактериальной смеси поместить покровное стекло.
3. Промокательной бумагой сильно прижать покровное стекло к предметному стеклу до появления тонкого коричневого слоя жидкости между ними. Удалить излишки жидкости.
4. Препарат смотреть под большим увеличением, применяя без- иммерсионные или иммерсионные объективы.
Оценка результатов. Капсулы выглядят прозрачными зонами вокруг микроорганизмов на коричневато-черном фоне.
Метод окраски по Бурри (Burri) является негативным методом: окрашивается фон, и не окрашиваются сами микроорганизмы. Для этого используют красители, неокрашивающие бактерии, например, тушь. Вместо туши можно использовать 10% раствор нигрозина или 20% раствор колларгола, или 3% раствор конго красного.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) тушь;
3) бактериологическая петля;
4) спиртовка.
Техника окраски:
1. На середину предметного стекла наносят каплю туши.
2. Эмульгируют в ней бактериальную петлю бульонной культуры или небольшую часть колонии, снятой с твердой питательной среды.
3. Ребром шлифованного стекла размазывают жидкость вдоль стекла.
4. Высушивают его на воздухе и, не фиксируя, микроскопируют с иммерсионной системой.
Оценка результатов. Фон препарата окрашен в темно-дымчатый цвет, микробные тела и капсулы не окрашиваются тушью и остаются бесцветными.
Метод окраски по Бурри-Гинсу (Burri, Gins) используется для окраски капсульных бактерий и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бурри.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) тушь;
3) смесь Никифорова (этиловый спирт и др.);
4) вода для промывания мазков;
5) карболовый фуксин Циля;
6) бактериологическая петля;
7) спиртовка.
Техника окраски:
1. Черную тушь смешивают с культурой, делают мазок препарата, как мазок крови и высушивают препарат.
2. После этого проводят фиксацию препарата химическим способом: смесью Никифорова или другими смесями.
3. Промывают водой.
4. Окрашивают тела микробных клеток карболовым фуксином Циля, разведенным 1:3, в течение 3-5 минут.
5. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.
Оценка результата. На темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, внутри которых находятся тела бактерий красного/ярко-малинового цвета. Иногда вокруг окрашенных бактерий, необразующих капсул, видны небольшие бесцветные зоны - ложные капсулы, которые появляются в результате неправильного высушивания или фиксации мазка.
Метод окраски по Ионе (Johne) - специальный метод для окраски капсул.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) дистиллированная вода;
3) 2% водный раствор генцианвиолета или метилвиолета;
4) 1-2% уксусная кислота;
5) бактериологическая петля;
6) спиртовка.
Техника окраски:
1. На приготовленный, высушенный и фиксированный мазок наливают пипеткой 2% водный раствор генцианвиолета (или метилвиолета) и нагревают 1-2 минуты, после чего препарат промывают водой.
2. Наносят 1-2%-ю уксусную кислоту на 5-10 с, промывают в воде.
3. Микроскопируют в воде.
Способ «негативной» окраски.
Материалы:
1) предметное и покровное стекла;
2) тушь;
3) фуксин;
4) бактериологическая петля;
5) спиртовка.
Техника окраски:
1. Небольшое количество клеток с плотной среды помещают на предметное стекло в каплю разбавленного фуксина.
2. Смешивают с каплей туши.
3. Закрывают покровным стеклом и просматривают с объективом х40.
Оценка результатов. На общем темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки микроорганизмов, окрашенные в розовый цвет.
МЕТОДЫ ОКРАСКИ НУКЛЕОИДА БАКТЕРИЙ
Окраска нуклеоида бактерий ядротропным методом Фельгена. Особое место среди разнообразных методов окраски ядерного вещества занимает метод, основанный на специфической реакции фуксинсернистой кислоты с альдегидными группами дезоксирибонуклеиновой кислоты, предложенный в 1924 г. Фельгеном и Россенбеком.
Сущность метода. Дезоксирибонуклеиновая кислота содержит в числе азотистых оснований тимин, кроме того, в ее состав входит четыре остатка пятиатомного сахара дезоксирибозы. Подвергая ядерные нуклеопротеиды слабому кислотному гидролизу, вызывают отщепление пириновых и пиримидиновых оснований, что обнажает молекулы дезоксирибозы. При гидролизе дезоксирибоза переходит в β-гидроксилевулиновый альдегид, который взаимодействует с сернистой частью бесцветной фуксинсернистой кислоты (реактив Шиффа), выделяя фуксин, тем самым вызывает появление специфической красно-фиолетовой окраски.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) жидкость Карнуа;
3) 80% этанол;
4) 1 N НСl;
5) фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа);
6) вода дистиллированная;
7) бактериологическая петля;
8) спиртовка.
Техника окраски:
1. Приготовить препарат из бактериальной культуры или дрожжей.
2. Высушить, зафиксировать в жидкости Карнуа 7 мин.
3. Промыть 80% этанолом.
4. Обработать 1 N НСl, подогретой до 60°С, в течение 7 мин, затем опустить препарат на 1-2 мин в холодную 1 N НСl.
5. Обработать фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа) в течение 3-4 часов.
6. Промыть водой, высушить, микроскопировать с иммерсией.
Оценка результата. Ядерное вещество окрашено в фиолетовый цвет.
Окраска ядерного вещества по методу Романовского-Гимзы. Этот способ применяется главным образом при микроскопии мазков-отпечатков из органов, мазков крови. Краситель Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура, благодаря чему он окрашивает в разные цвета элементы микроорганизма и форменные элементы крови. Перед обработкой препарата краситель необходимо развести водой (pH 7,0-7,2) в 10-20 раз. Степень разведения меняется в зависимости от серии красителя и pH воды. Поэтому рекомендуется каждую новую серию красителя и воду проверять на мазках крови.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) жидкость Карнуа или смесь Никифорова;
3) коммерческий раствор Романовского-Гимзы;
4) дистиллированная вода;
5) бактериологическая петля;
6) спиртовка.
Техника окраски:
1. Приготовленный препарат высушивают на воздухе.
2. Фиксируют жидкостью Карнуа или смесью Никифорова.
3. Фиксированные мазки подсушивают на воздухе и окрашивают рабочим раствором Романовского-Гимзы (к 10 мл дистиллированной воды добавляют 10 капель коммерческого красителя Романовского- Гимзы), погружая стекло в стаканчик с красителем.
4. Через 1 ч краситель сливают, и препарат промывают дистиллированной водой.
5. Готовый препарат высушивают на воздухе и микроскопируют.
Оценка результатов. Протоплазма форменных элементов ткани простейших окрашивается в голубовато-синий цвет, ядра клеток - в фиолетово-красный, тела микробных клеток приобретают фиолетово-красный цвет.
Элементы крови окрашиваются: эритроциты - в розовый цвет, ядра лейкоцитов - в фиолетовый, цитоплазма - в голубой, базофильная зернистость - в синий, эозинофильная - в красный, нейтрофильная - в сиреневый.
Метод Пикарского.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) 1N раствор НСl;
3) коммерческий раствор Романовского-Гимзы;
4) дистиллированная вода;
5) бактериологическая петля;
6) спиртовка.
Техника окраски:
1. Препарат обрабатывают 1N раствором НСl при подогревании до 60°С в течение 7 мин.
2. Промыть препарат водой и дальше окрашивать по Романовскому-Гимзе.
Оценка результатов. Ядерные элементы темно-красные, цитоплазма - розовая.
МЕТОДЫ ОКРАСКИ ВКЛЮЧЕНИЙ В БАКТЕРИЯХ
У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме содержатся включения в виде гранул гликогена, полисахаридов, поли-β-масляной кислоты, отложения жира, серы, различных кристаллов и волютина - полифосфата.
Окраска зерен волютина. Волютин накапливается при избытке питательных веществ в окружающей среде. В клетке он выполняет роль запасных веществ для питания и энергетических потребностей. Зерна волютина обладают метахромазией и легко выявляются при специальных методах окраски. Термин «волютин» предложен Мейером, обнаружившим его впервые у бактерий Spirillum volutans. Волютин - запасное фосфор- и азотсодержащее вещество, производное нуклеиновой
кислоты. Характерное свойство волютина - его метахромазия - способность приобретать в иной цвет, чем цвет окрашивающего вещества (метиленовый синий окрашивает волютин в фиолетово-красный цвет).
1. Выявление зерен волютина с помощью метиленового синего.
Способ метахроматического выявления волютиновых зерен у коринебактерий и скоплений нуклеиновых соединений у бактерий.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) водно-спиртовый раствор метиленового синего;
3) вода для промывания мазков;
4) бактериологическая петля;
5) спиртовка.
Техника окраски:
1. На готовый зафиксированный мазок наносят 1-2 капли водноспиртового раствора метиленовой синьки. Красят 3-5 минут.
2. Сливают краску, ополаскивают водой, высушивают.
3. Микроскопируют с иммерсионной системой.
Оценка результатов. На мазке - клетки голубого цвета с синими, почти черными зернами волютина (зависит от интенсивности действия красителя).
2. Выявление зерен волютина с помощью уксуснокислого метилового фиолетового.
Используется для выявления гранул волютина при диагностике дифтерии. Вследствие высокой концентрации метафосфатов и других соединений фосфора гранулы волютина при окраске уксуснокислым метиловым фиолетовым имеют более интенсивный цвет по сравнению с цитоплазмой.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) уксуснокислый раствор метилового фиолетового (метиловый фиолетовый, генциановый или кристаллический фиолетовый - 0,25 г, 5%-й раствор уксусной кислоты - 100 мл);
3) вода для промывания мазков;
4) бактериологическая петля;
5) спиртовка.
Техника окраски:
1. На готовый зафиксированный мазок наносят 1-2 капли уксуснокислого раствора метилового/генцианового фиолетового. Красят 5-10 минут.
2. Сливают краску, ополаскивают водой, высушивают.
3. Микроскопируют с иммерсионной системой.
Оценка результатов. На мазке - цитоплазма дифтерийных кори- небактерий окрашивается в светло-сиреневый цвет, гранулы волютина - в темно-лиловый.
3. Метод окраски по Нейссеру (Neisser) используется для выявления зерен волютина. Мазок окрашивается уксуснокислым метиленовым синим, при этом происходит химическое взаимодействие красителя и волютина. При промывке водой тело клетки обесцвечивается и затем докрашивается везувином.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) уксуснокислая метиленовая синь Нейссера;
3) раствор Люголя;
4) вода для промывания мазков;
5) раствор везувина (хризоидина);
6) бактериологическая петля;
7) спиртовка.
Техника окраски:
1. Готовят мазок, высушивают, фиксируют жаром.
2. Наливают на мазок 1-2 капли уксуснокислого метиленового синего Нейссера, красят 1-2 минуты.
3. Краску сливают, наносят раствор Люголя на 1 мин.
4. Промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой.
5. Наносят раствор везувина (хризоидина) для окраски тела бактерии на 1-3 мин.
6. Смывают водой, высушивают, микроскопируют.
Оценка результатов. В мазке цитоплазма бактерий окрашивается в желто-коричневый цвет, зерна волютина - от сине-зеленого до синечерного цвета.
4. Окраска по Раскиной.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) карболовый фуксин Циля;
3) краситель Раскиной;
4) вода для промывания мазков;
5) бактериологическая петля;
6) спиртовка.
Техника окраски:
1. На препарат, высушенный на воздухе, предварительно нефиксированный, наливают краситель Раскиной.
2. Препарат подогревают на пламени до сгорания спирта.
3. Промывают водой и высушивают, микроскопируют с иммерсией.
Оценка результатов. Бактерии окрашиваются в светло-красный цвет, а зерна волютина - в черно-синий (темно-вишневый).
5. Окраска по Мейеру.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) метиленовый синий Леффлера;
3) 1% раствор серной кислоты;
4) 40% водный раствор КОН;
5) 0,25% раствор светлого зеленого или хризоидина;
6) вода для промывания препаратов;
7) бактериологическая петля;
8) cпиртовка.
Техника окраски:
1. Готовят параллельно два препарата, фиксируют их на пламени спиртовки.
2. В течение 10 минут окрашивают препараты метиленовым синим Леффлера.
3. Затем один препарат погружают на 5 мин в 1% раствор серной кислоты (препарат №1), другой настолько же в 40% водный раствор КОН (препарат №2).
4. Непромывая, препараты подсушивают фильтровальной бумагой и докрашивают 0,25% раствором светлого зеленого или хризоидина.
5. Затем промывают водой и высушивают.
Оценка результатов. На препарате №1 цитоплазма бактерий окрашена в желто-коричневый или зеленый цвет, включения волютина - в вишнево-красный.
На препарате №2 гранулы волютина обесцвечены и выглядят пустыми непрокрашенными на фоне слабо окрашенных бактерий.
6. Окраска по Омелянскому.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) фуксин Циля;
3) 1% раствор серной кислоты (Н2SO4);
4) метиленовый синий (1:40);
5) вода для промывания препаратов;
6) бактериологическая петля;
7) спиртовка.
Техника окраски:
1. Фиксированный препарат окрашивают раствором фуксина Циля в течение 30-60 сек.
2. Препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.
3. Наносят на препарат 1%-ный раствор Н2SO4 на 20-30 секунд.
4. Препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.
5. Докрашивают препарат метиленовым синим 15-30 секунд.
6. Промывают его водой и подсушивают фильтровальной бумагой.
7. Препарат микроскопируют в иммерсионной системе с объективом х90.
Оценка результатов. Гранулы волютина красного цвета, клетки - синего.
Окраска гликогена. Гликоген - углевод, животный крахмал (полисахарид). Часто он накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Известно, что гликоген встречается у бактерий чаще, чем крахмал. Запасные полисахариды используются микроорганизмами в качестве источников углерода и энергии.
Материалы:
1) предметное и покровное стекла;
2) раствор йода в йодистом калии:
✵ йод - 7 г;
✵ йодистый калий - 20 г;
✵ дистиллированная вода - 100-300 мл;
3) фильтровальная бумага;
4) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
5) спиртовка.
Техника окраски:
1. На чистое предметное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизма, и к ней добавляют такую же каплю раствора йода в йодистом калии (7 г йода и 20 г йодистого калия в 100-300 мл дистиллированной воды) на 2-3 минуты.
2. Сверху помещают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой.
3. Препарат просматривают с масляной иммерсией (на покровное стекло наносят каплю масла) с объективом х40.
Оценка результатов. Цитоплазма клеток окрашивается в светло- желтый цвет, а гранулы гликогена - в красно-бурый.
Окраска гранулезы. Гранулеза - углевод, крахмалоподобное вещество. В больших количествах накапливается в клетках маслянокислых бактерий (Clostridium acetobutyricum) перед спорообразованием.
Материалы:
1) предметное и покровное стекла;
2) раствор Люголя;
3) фильтровальная бумага;
4) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
5) спиртовка.
Техника окраски:
1. В небольшую каплю суспензии маслянокислых бактерий добавляют небольшую каплю раствора Люголя.
2. Закрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой.
3. На покровное стекло наносят каплю масла и просматривают с иммерсионной системой.
Окраска жира. Жир содержится в клетках практически всех микроорганизмов, особенно много его накапливается при старении культуры.
Материалы:
1) Судан III (0,1 г Судана III растворяют в 200 мл 90° спирта);
2) 40% раствор формалина;
3) раствор метиленового синего (1:40);
4) предметное и покровное стекла;
5) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
6) cпиртовка.
Техника окраски:
1. На предметное стекло наносят небольшую каплю 40% раствора формалина.
2. Петлей в нее вносят культуру микроба. Формалин убивает клетку и разрыхляет ее оболочку.
3. Через 5 мин в эту же каплю добавляют небольшую каплю метиленового синего (1:40), а спустя 10 минут каплю Судана III (растворимого в жире красителя, индикатора жироподобных веществ).
4. Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой.
5. Микроскопируют препарат с иммерсией.
Оценка результатов. Цитоплазма клеток окрашивается в синий цвет, включения жира - в розово-оранжевый.
Окрашивание поли-β-оксимасляной кислоты. Запасным жироподобным веществом многих бактерий (например, рода Pseudomonas) является поли-β-гидроксимасляная кислота. Поли-β-гидроксимасляная кислота - хороший источник углерода и энергии.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) 0,3% раствор Судана черного В, приготовленный на этиленгликоле;
3) ксилол;
4) 0,5% водный раствор сафранина;
5) вода для промывания препаратов;
6) бактериологическая петля;
7) спиртовка.
Техника окраски:
1. Фиксированный нагреванием мазок на предметном стекле погружают в 0,3% раствор Судана черного В, приготовленного на этиленгликоле. Окрашивают 5-15 мин (время подбирают экспериментально).
2. Препарат высушивают на воздухе.
3. Предметное стекло погружают несколько раз в ксилол, затем впитывающим материалом подсушивают препарат.
4. Окрашивают препарат в 0,5% водном растворе сафранина 5-10 с.
5. Промывают водой, высушивают на воздухе, микроскопируют.
Оценка результата. Включения поли-β-оксимасляной кислоты -капельки черно-синего цвета, цитоплазма бактерий окрашивается в розовый цвет.
Окрашивание гранул полифосфата.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) раствор метиленового синего по Леффлеру или 1% раствор толуидинового синего;
3) вода для промывания мазков;
4) бактериологическая петля;
5) спиртовка.
Техника окраски:
1. Мазок на предметном стекле фиксируют нагреванием.
2. Наносят на препарат на 10-30 с раствор метиленового синего по Леффлеру или 1% раствор толуидинового синего.
3. Промывают препарат водой.
4. Высушивают на воздухе, микроскопируют.
Оценка результатов. При окраске метиленовым синим - гранулы полифосфата в виде шариков синего или фиолетового цвета, цитоплазма окрашивается в светло-голубой цвет. Толуидиновый синий окрашивает метахроматически, гранулы имеют красный цвет на голубом фоне цитоплазмы.
ВЫЯВЛЕНИЕ ЖГУТИКОВ У ПОДВИЖНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Жгутики окрашиваются с трудом, поэтому для их окраски применяют протравы, которые увеличивают толщину жгутиков и повышают возможность их окраски. При изготовлении препаратов для обнаружения жгутиков необходимо пользоваться очень чистыми, хорошо обезжиренными стеклами. Рекомендуется работать с новыми покровными стеклами, которые предварительно кипятят 10 мин в хромовой смеси. После кипячения стекла промывают в течение 5 мин в слабом растворе гидроксида натрия (NаОН), затем обильно промывают водой, ополаскивают спиртом и помещают в банки со смесью Никифорова. Из банок стекла вынимают чистым пинцетом, смесь Никифорова удаляют прижиганием стекла на огне. При изготовлении препаратов используют молодые микробные культуры (12-16-часовые), выращенные при оптимальной для данного вида микроба температуре.
Метод окраски по Морозову предназначен для обнаружения вирусов путем импрегнации серебром, а также выявления микроструктуры бактерий (в том числе риккетсий, спирохет), жгутиков, аргирофильных и аргентофильных включений и гранул.
Принцип метода состоит в том, что при обработке мазков таниновыми препаратами жгутики бактерий становятся более рыхлыми, объемистыми и доступными для воздействия на них азотистого серебра. Кроме того, при обработке препарата аммиачным раствором серебра эта соль восстанавливается в исследуемом объекте, и специфические ингредиенты объекта избирательно окрашиваются в коричневато-черный цвет.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) дистиллированная вода;
3) преципитационная пробирка;
4) 1% раствор формалина;
5) бактериологическая петля;
6) спиртовка;
7) реактивы:
✵ Реактив №1: 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды.
✵ Реактив №2: 5 г танина, 1 мл жидкой карболовой кислоты, 100 мл дистиллированной воды.
✵ Реактив №3: 5 г кристаллического нитрата серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой сосуд, к оставшимся 80 мл раствора серебра по каплям добавляют раствор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется легкая опалесценция. Если аммиака будет слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо по каплям добавлять его до получения нужной слабой опалесценции.
Для окраски препарата раствор серебра разводят дистиллированной водой 1:10.
Техника окраски:
1. Прокаленной и охлажденной петлей слегка прикасаются к поверхности колоний или газонного роста микробной культуры, чтобы не вызвать механического повреждения жгутиков.
2. Полученный материал переносят в преципитационную пробирку, на дно которой налито 0,1-0,2 мл 1% раствора формалина. Петлю оставляют в неподвижном состоянии на несколько минут. За это время часть микробов переходит с петли в раствор. Эту процедуру повторяют 2-3 раза, пока жидкость не станет слабо опалесцировать.
3. Приготовленную взвесь ставят на 1-2 ч в термостат при 37°С для равномерного распределения микроорганизмов в жидкой среде.
4. Затем в пробирку с 1,5-2 мл дистиллированной воды вносят 1-2 капли формалиновой бактериальной взвеси. Через 10-15 мин, после того как бактерии относительно равномерно распределятся по всему объему жидкости, наносят 5-6 капель полученной взвеси на предметное стекло, не касаясь его петлей.
5. Капли высушивают на воздухе, не размазывая.
6. Для лучшего протравливания обрабатывают их реактивом №1 (ледяная уксусная кислота с формалином) в течение 1 мин.
7. Остатки протравы сливают, мазок промывают водой.
8. После подсыхания мазка на препарат наливают реактив №2, подогревают на легком пламени до появления паров (1 мин).
9. Тщательно промывают водой (1-2 мин).
10. На подсушенный после промывания препарат наносят реактив №3 и выдерживают его до появления темно-коричневой окраски мазка.
11. Тщательно промывают водой.
12. Высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.
Оценка результатов. Тела микробных клеток окрашиваются в коричневато-черный (угольно-черный) цвет, жгутики приобретают различные оттенки коричневого цвета и отчетливо видны на окрашенном в слабожелтый цвет фоне.
Метод окраски по Грею основан на искусственном увеличении жгутиков за счет нанесения протравы.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) вода для промывания мазков;
3) карболовый фуксин Циля;
4) бактериологическая петля;
5) спиртовка;
6) реактивы:
✵ Реактив №1: насыщенный водный раствор калийных квасцов - 5 мл, 20%-й водный раствор танина - 2 мл, насыщенный водный раствор хлорида ртути - 2 мл.
✵ Реактив №2: насыщенный спиртовой раствор основного фуксина - 0,4 мл.
Протраву, состоящую из растворов №1 и №2, готовят за сутки до использования.
Техника окраски:
1. Протраву наливают на препарат на 8-10 мин.
2. Промывают водой и окрашивают карболовым фуксином Циля 5 мин.
3. Мазок промывают водой.
4. Высушивают на воздухе и микроскопируют.
Оценка результатов. Жгутики окрашиваются в красный цвет.
Метод окраски по Шенку.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) вода для промывания мазков;
3) метиленовый синий Леффлера или 1%-й спиртовый раствор сафранина;
4) бактериологическая петля;
5) спиртовка;
6) реактивы:
✵ Реактив №1: 30 мл насыщенного водного раствора танина и 10 мл 5%-го водного раствора хлорида железа.
✵ Реактив №2: 1 мл анилина и 4 мл 95%-го этилового спирта.
Техника окраски:
1. Протраву, состоящую из растворов №1(8 капель), и №2 (1 капля), наносят на мазок.
2. Протраву сливают.
3. Мазок окрашивают метиленовым синим Леффлера или 1%-м спиртовым раствором сафранина.
ОКРАСКА ХЛАМИДИЙ
Материалы:
1) предметное стекло;
2) водопроводная вода;
3) метиловый спирт;
4) 96% этиловый спирт;
5) 10% раствор Люголя;
6) бактериологическая петля;
7) спиртовка.
Техника окраски:
1. Мазки фиксируют 10 минут метиловым спиртом, затем 20 минут 96% этиловым спиртом.
2. После фиксации на препарат наносят 10% раствор Люголя и окрашивают 5 минут.
3. Краситель сливают, микропрепарат промывают водой.
4. Высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой (окуляр х7, х10, объектив х100).