Эволюция вирусов - Жданов В. М. 1990

Специальная часть
Плазмиды

Плазмиды (эписомы, экстрахромосомные генетические домены) до сих пор большинство микробиологов не относят к царству вирусов, хотя вирусологи говорят о персистенции папилломавирусов в виде эписом, об эписомах герпесвирусов и даже и двувитевых киллерах дрожжей как об эписомах. Между тем если исходить из определения вирусов как автономных генетических структур, то плазмиды вполне подходят под это определение. От обычных вирусов плазмиды имеют три главных отличия: они не способны самостоятельно реплицироваться, поскольку не имеют естественных репликаз, они не обладают собственными структурными белками и белковыми оболочками, существуют в виде «голых» нуклеиновых кислот. Однако все эти особенности не абсолютны и присущи в той или иной мере образованиям, в вирусной природе которых никто не сомневается. Неспособность к самостоятельной репликации свойственна многим вирусам-сателлитам, дефектным вирусам и фактически всем ДНК-coдержащим вирусам.

Отсутствие существенных различий между вирусами и плазмидами было показано на модели сателлитного фага Р4 [Goldstein R. et al., 1982]. Он реплицируется в присутствии фага- помощника Р2, который обеспечивает его необходимыми генными продуктами, включая капсидные белки. Этот фаг может также размножаться в отсутствие помощника как профаг, интегрированный в геном Е. coli. Он, наконец, может размножаться как плазмида. Эти данные указывают на близость между дефектными вирусами и плазмидами.

К самостоятельной репликации не способны целые группы вирусов, например, парвовирусы-сателлиты, которые реплицируются только в присутствии адено- и герпесвирусов, дельтавирус, размножающийся только в присутствии гепаднавирусов. Многие онковирусы являются дефектными по гену pol, кодирующему синтез полимеразы, и репликация их возможна лишь в присутствии близкородственного вируса-помощника, имеющего полноценный геном.

Наконец, следует напомнить, что все ДНК-содержащие вирусы, за исключением вирусов оспы, лишь частично реплицируют геном собственными ДНК-полимеразами. Сложный механизм синтеза их ДНК обеспечивается системой клеточного синтеза ДНК даже у вирусов с большим геномом (герпесвирусы), а у вирусов с небольшим геномом (лаповавирусы) вклад собственных факторов синтеза ДНК минимален.

Далеко не все вирусы имеют собственные вирионные белки, в которые упакован геном. Кроме уже упомянутого сателлита фага Р4, назовем дельта-вирус, имеющий собственный капсид, а его внешняя оболочка «составлена» из структуры вируса гепатита В. Многие из онковирусов, дефектных по генам env, получают оболочку размножающего их полноценного вируса. Этот феномен, обозначенный как образование псевдотипов, легко воспроизводится экспериментально и, по-видимому, существует в природе. В частности, таким путем удается получить вирионы, содержащие генетический материал онковирусов и оболочку вируса везикулярного стоматита. Более того, при несбалансированных синтезах в субклеточных фракциях образуются структуры, содержащие генетический материал вируса и оболочки из клеточных белков [Жданов В. М. и др., 1970].

Противопоставление вирусов, плазмид и других экстрахромосомных автономных генетических структур теряет смысл в свете экспериментов по генетической инженерии. Плазмиды удается конструировать из бактериальных вирусов и даже из хромосомных элементов клетки. Так, V. Zakian и J. Scott (1982) сконструировали плазмиду TRPI R1 circle, целиком состоящую из 1453 пар нуклеотидов дрожжевой хромосомной ДНК. Эта плазмида реплицировалась в дрожжевых клетках до 100—200 копий на клетку с помощью продуктов генов, ответственных за репликацию дрожжевой ДНК. Авторы считают источниками возникновения плазмид последовательности дрожжевой ДНК, называемые автономно реплицирующимися последовательностями (ARS). Поэтому сконструированная плазмида является хорошей моделью для изучения репликации дрожжевой ДНК.

О возможном клеточном происхождении некоторых плазмид свидетельствуют данные исследований митохондриальной плазмиды грибов Neurospora. Эта плазмида имеет длинную открытую рамку считывания, кодирующую гидрофильный белок (его молекула состоит из 710 аминокислотных остатков и по организации весьма сходна с нитронами митохондриальной ДНК I группы) [Nargand F. et al., 1984].

Как и ординарные вирусы, плазмиды легко преодолевают барьеры даже таких эволюционно далеких таксономических групп, как бактерии и дрожжи (про- и эукариоты). Получены гибридные плазмиды бактериального происхождения, эффективно реплицирующиеся в дрожжах и вызывающие их трансформацию. Сконструированы плазмиды из ДНК вируса бычьей папилломы и рВР322, которые реплицируются в мышиных и бактериальных клетках. Сконструирована плазмида из ДНК хромосом мышиных клеток, которая оказалась способной реплицироваться в дрожжах [Roth G. et al., 1983].

Со времени открытия, вернее, понимания природы плазмид [Jacob R, Wollman Е., 1958] им посвящена громадная литература, в том числе монографии. Поэтому нет никакой надобности сколько-нибудь подробно, описывать многочисленные естественные я искусственно созданные плазмиды. Отметим лишь, что обычно это двунитевые циркулярные молекулы ДНК. Основными группами плазмид по функциональному признаку являются колициногенные факторы, факторы фертильности, факторы устойчивости к лекарственным веществам. Однако существуют и другие группы плазмид, о которых будет сказано ниже.

Половая гибридизация бактерий, являющихся гаплоидными организмами, связана с особой группой плазмид, названных факторами фертильности [Cavalli-Storza L. et al., 1953]. Фактор фертильности, т. е. плазмида, может находиться в клетке как в автономном, так и в интегрированном состоянии, и именно в этом виде он обеспечивает половой процесс, т. е. обмен генетическим материалом. Колициногенные, или шире — бактериоциногенные, факторы также являются плазмидами, на которых закодированы белки, обладающие токсигенными свойствами для соответствующих бактерий [Gratia А., 1925]. Аналогичным действием обладают киллеры дрожжей, являющиеся двунитевыми РНК, и токсины для комаров, вырабатываемые Bacillus thuringiensis.

Вирулентность энтеробактерий и вибрионов также связана с плазмидами (соответственно, pColV-К30 и pJM1), которые обеспечивают усвоение железа, что необходимо для интенсивного размножения бактерий. Несмотря на сходство функций, обе плазмиды не обладают гомологией ДНК [Walter М. et al., 1984].

На модели плазмиды pHW400, имеющей молекулярную массу 6x10⁶, с которой связана вирулентность дизентерийной шигеллы, было показано, что она кодирует белок с молекулярной массой 41 000. Он участвует в формировании специфической боковой цепи липопошисахарида, одного из факторов вирулентности [Watanabe Т. et al., 1984]. Другая плазмида (молекулярная масса 140 x 10⁶) обеспечивает проникновение бактерий в клетки.

У чумной палочки и других Yersinia (pestis, enterocolitica, pseudotuberculosis) имеются плазмиды, обеспечивающие их вирулентность. Эти плазмиды кодируют белки наружных мембран б.актерий, в частности К-антиген, с которым связана вирулентность бактерий этого рода [Portnoy D. et al., 1984]. Многие токсины (экзотоксины) кодируются плазмидами, в частности термолабильный энтеротоксин кишечной палочки, сходный с холерным энтеротоксином, и дифтерийный токсин, который могут вырабатывать разные виды Corynebacterium (diphtheriae, ulcerans, pseudotuberculosis) [Wong T., Groman N., 1984].

Имеются также основания считать, что токсинообразование сибиреязвенной бациллы связано с плазмидой [Mikesell Р. et al., 1983]. Выработка токсинов у Bacillus thuringiensis обусловлена наличием у них плазмид. У этого вида бактерий обнаружено 6 плазмид с молекулярной массой от 3,6 х 10⁶ до 105 х 10⁶. Таким образом, наиболее крупные плазмиды имеют ДНК, характерную для крупных фагов. Токсичность для комаров связана с одной из этих плазмид, рТХ14-3. Плазмиды обусловливают продукцию токсина Bacillus anthracis. Вирулентность нефропатогенных штаммов кишечной палочки и инвазионные свойства Shigella flexneri также связаны с плазмидами.

Значительное число плазмид передает бактериям устойчивость к лекарственным веществам, в том числе множественную устойчивость к антибиотикам. Природа этого R-фактора оказалась разной: в одних случаях лекарственная устойчивость трансдуцирована умеренными фагами, в большинстве же случаев — плазмидами, как автономными, так и интегра- бельными [Watanabe Т., 1963]. В основе действия этого фактора лежит синтез ферментов, модифицирующих или инактивирующих соответствующие антибиотики.

Плазмиды устойчивости к антибиотикам могут реплицироваться в разных видах. Так, плазмида рВС16 устойчивости к тетрациклину и плазмида устойчивости к хлорамфениколу (молекулярная масса соответственно 28 x 10⁶и 18 x 106) легко передаются разным видам Bacillus (anthracis, cereus, thuringiensis), особенно в присутствии трансдуцирующего фага CP-51 [Ruhfel R. et al., 1984]. С помощью плазмид ген устойчивости к ампициллину (ген ß-лактамазы) Staphylococcus aureus был передан Bacillus subtills при интеграции его в хромосому [Saunders С. et al., 1984]. В настоящее время можно считать также доказанным, что образование опухолей у растений («корончатые галлы») связано с интеграцией Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, несущей ген J, в хромосомы поражаемых растений. При этом «хозяйская» специфичность определяется особыми множественными генами.

Образование «корончатых галлов» у двудольных растений является сложным процессом взаимодействия генетического материала про- и эукариот. Этот процесс вызывается грамотрицательными бактериями — носителями Ті (tumor-inducing) плазмид, часть ДНК которых, Т-ДНК (transfer DNA), переносится в растительные клетки и интегрирует с их геномом. Таким образом, образование опухолей растений, как и опухолей животных, связано с интеграцией чужеродного (в данном случае плазмидного) генетического материала. Сходные процессы вызываются в корнях растений («бородатый корень») при переносе в них плазмид Ri Agrobacterium rhizobium.

Плазмиды Tl у разных штаммов варьируют по величине генома (от 90 x 106 до 160 x 106). Их можно разделить на три типа: кодирующие метаболизм октопина и агропина, кодирующие метаболизм попилина, ориолина и агроцианинов, кодирующие метаболизм только агропина. Эти вещества утилизируются клетками агробактерий в качестве источника углерода и азота, поэтому их метаболизм зависит от плазмид, содержащих соответственные гены, а опины (производные аминокислот) в свою очередь продуцируются клетками «корончатых галлов». Таким образом, растения, бактерии и плазмиды представляют собой сложную трехчленную симбиотическую систему, в которой явные «выгоды» имеют бактериальные и вирусные партнеры.

Структурный ген для мРНК октопин-синтазы находится в центральной части плазмиды Ті и экспрессируется в растительных клетках. Молекулярная масса октопин-синтазы составляет около 40 000 [Murad N., Kemp J., 1982].

Между прочим, при изучении плазмиды Ті и вызываемых ею опухолей показана возможность рекомбинации ДНК про- и эукариотов в естественных условиях. Сходные явления происходят при взаимодействии плазмид Agrobacterium rhizogenes, вызывающих заболевания корней дикотиледоновых растений (илазмидная ДНК интегрирует с ДНК. клетки) [Chilton М. et al., 1982].

Происхождение плазмид неоднократно обсуждалось и наиболее общепринятое мнение заключается в том, что плазмиды являются дериватами фагов. Это подкрепляется данными о сходстве действия колицинов и белков отростков фагов, способности передавать устойчивость к антибиотикам как фагами, так и плазмидами, наконец, о возможности искусственно превращать фаги в плазмиды. Однако, соглашаясь с этим заключением, следует также принять и другое объяснение — возможность возникновения плазмид из бактериальных хромосом. Экспериментально это, как уже упоминалось, было неоднократно воспроизведено. Можно предположить поэтому, что ряд плазмид произошел именно таким образом. В частности, это относится к плазмидам класса R. Соседствуя с грибами, вырабатывающими антибиотики, бактерии могли в ходе эволюции образовать гены, кодирующие ферменты, которые разрушают или модифицируют антибиотики. Однако не всегда этот дополнительный генетический «груз» был необходим, и бактерии могли освободиться от него, вычленив соответствующие гены из хромосомы. Для их размножения было необходимо в соответствующей (обычно кольцевой) структуре иметь сайт начала репликации. Ставши автономными, такие генетические структуры подвергались действию законов эволюции и, возможно, от них произошли некоторые обычные вирусы.

Плазмиды обычно находятся в свободном состоянии, они связаны с бактериальными хромосомами, однако могут быть и интегрированы (частично или полностью) в бактериальные хромосомы. Так, плазмида рМС7105 Pseudomonas syringae (150 кб) встраивается в бактериальную хромосому, а при вырезании ее фрагментов из хромосомы образуется несколько мелких плазмид [Szabo L., Mills D., 1984].

Существуют плазмиды с широким спектрам «хозяев», например, плазмиды несовместимости группы Р (ІnсР), которые могут стойко поддерживаться в любом виде грамотрицательных бактерий. К ним близки плазмиды RK2 и другие из этой группы (P1, RP4, R68, R18, R751). При изучении плазмиды К2 было показано, что она кодирует три летальных для «хозяина» гена (kil), которые регулируются специальным геном (kor) этой же плазмиды [Young С. et al., 1984].

О быстроте эволюции плазмид можно судить по появлению структур, разрушающих синтетические вещества. Так, некоторые флавобактерин содержат плазмиды, разлагающие олигомер нейлона. Циклический димер 6-аминогексаноевой кислоты (нейлон) разрушается с помощью гидролазы, закодированной в плазмиде [Negoro С. et al., 1984].

Плазмиды — мощные факторы адаптации микробов к неблагоприятным условиям среды. Они и другие внехромосомные факторы наследственности вносят вклад в изменчивость геномов бактерий. Взаимодействие плазмид и их отдельных генов с транспозонами приводит к встраиванию новых генов и влияет на эволюцию микроорганизмов. Но вклад в уже дивергировавшие виды невелик. Имеются силы, удерживающие гены в хромосомах и плазмидах. В табл. 5 приведены некоторые функции, обеспечиваемые плазмидами [Хмель И. X., 1985]. В обзоре И. X. Хмеля рассматриваются как источники происхождения плазмид фаги (например, плазмида λdv из фага λ), бактериальные хромосомы (от них происходят колицины). В этом смысле плазмиды и вирусы могут иметь общее происхождение. С этой точки зрения представляет интерес изучение систем, в которых сосуществуют плазмиды и фаги, функционально сходные (например, системькхолерных вибрионов). Эволюционное значение их многообразно и рассмотрено в этой главе лишь частично.

Таблица 5. Биологические функции, определяемые плазмидами

¹ Приведены плазмиды, определяющие указанную функцию. Плазмиды, для которых не указаны «хозяева», обычно встречаются (или могут существовать) в клетках Е. coli.

Таким образом, прионы, вироиды и плазмиды являются как бы начальными стадиями формирования вирусов. Сравнительное их изучение позволяет понять возможные источники происхождения двух больших групп вирусов — ДНК- и РНК-содержащих.