Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968
Химические реакции белков, определение концевых и функциональных групп белков
Определение N- и С-концевых аминокислот
Как известно, аминокислотные остатки, стоящие на концах полипептидных цепей, подразделяются на N-концевые, т. е. имеющие свободную NH2-группу, и С-концевые, т. е. имеющие карбоксильную группу. Методы определения и тех и других концевых аминокислот подразделяются на химические и ферментативные.
Выше мы уже рассмотрели основные химические методы определения N-концевых групп (динитрофторбензольный метод Сэнджера, фенилизотиоцианатный метод Эдмана и пипсилхлоридный метод). Здесь же только заметим, что наиболее широко для этих целей используются методы Сэнджера и Эдмана.
Для ферментативного определения N-концевых групп иногда применяют и аминопептидазы — ферменты, которые последовательно отщепляют аминокислоты с N-конца полипептидной цепи. Наиболее хорошо изученным и часто применяемым ферментом является лейцинаминопептидаза, выделяемая из почек свиньи. Этот энзим был использован для изучения N-концевой последовательности инсулина и рибонуклеази. В опытах на синтетических пептидах и амидах аминокислот было показано, что весьма медленно отщепляются те N-концевые аминокислоты, рядом с которыми стоят лизин, аргинин и ароматические аминокислоты. Эта относительно узкая специфичность действия энзима затрудняет его применение; специфичность действия других аминопептидаз изучена недостаточно.
Что касается изучения С-концевых аминокислот, то единственным достаточно надежным химическим приемом их изучения является метод гидразинолиза. К сожалению, как отмечалось выше, гидразиды некоторых аминокислот легко переходят в свободные аминокислоты, что может существенно исказить результаты анализа и ограничивает применение этого доступного и простого метода. Поэтому для определения С-концевых аминокислот чаще используют ферментативный метод.
Для энзиматического определения С-концевых групп применяют карбоксипептидазу. Карбоксипептидаза расщепляет в белках только те пептидные связи, которые смежны со свободной а-карбоксильной группой. Следовательно, при действии фермента на белок первой от полипептидной цепи отщепляется С-концевая аминокислота, затем начинает отщепляться следующая за ней и т. д. Таким образом, карбоксипептидаза осуществляет постепенное расщепление белка с С-конца.
Метод прост для выполнения, но требует тщательной очистки фермента; малейшая примесь в нем каких-либо протеиназ (например, трипсина или химотрипсина) резко искажает результаты. Поэтому в инкубационную среду обычно добавляют специфический ингибитор этих ферментов — диизопронилфторфосфат, не оказывающий какого-либо действия на карбоксипептидазу. Белок инкубируют в течение различных сроков с карбоксипептидазой, фермент инактивируют, белки осаждают, а в безбелковом фильтрате количественно определяют отщепившиеся аминокислоты. Для каждой аминокислоты строят график увеличения ее содержания в безбелковом фильтрате во времени. Очевидно, что наибольшая интенсивность накопления должна быть для концевой аминокислоты, несколько меньшая для следующей и т. д. Таким образом, удается установить последовательность расположения в полипептидной цепи нескольких аминокислотных остатков (7—10) с С-конца.