Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968
Определение величины и формы белковых молекул
Определение величины и пространственной геометрии белковой молекулы является более трудной задачей, чем установление ее первичной структуры. Причины трудностей заключены как в несовершенстве применяемых для этих целей физико-химических методов, так и в высокой лабильности выделенных белков и их склонности к денатурации даже при самых оптимальных условиях выделения и хранения.
Наиболее точные данные о величине и форме белковой молекулы, включая конформацию полипептидных цепей и характер взаимодействия боковых радикалов, можно получить только с помощью рентгеноструктурного анализа. Правда, практические трудности, связанные с этим методом, таковы, что к настоящему времени его удалось применить только к весьма ограниченному числу белков. Для большинства же изученных препаратов вся доступная информация была получена с помощью менее совершенных, но зато и менее сложных физико-химических методов, которые позволяют использовать белковые растворы. Эти методы не дают, как правило, точных сведений о деталях молекулярной архитектуры, и получаемое с их помощью «изображение* молекулы настолько несовершенно, что по нему можно оценить лишь ее очертания и форму. Однако они позволяют определить основные физические характеристики макромолекул, которые не только дают общие представления об их строении, но и позволяют применять более чувствительный метод дифракции рентгеновых лучей. Каковы же основные характеристики белковых препаратов, устанавливаемые этими методами?
К ним прежде всего следует отнести молекулярную гомогенность, т. е. число и относительные количества видов отдельных молекул в изучаемом образце. Сведения о молекулярной гомогенности являются несомненно важными для более тонких исследований вторичной и третичной структур. Методы, которые дают информацию этого рода, зависят от различных скоростей движения отдельных компонентов в силовом поле, которое в случае осаждения (седиментации) является гравитационным, а в случае электрофореза — электрическим (см. гл. VII).
Во-вторых, с помощью физико-химических методов, применимых к белковым растворам, можно установить молекулярный вес. Он может быть определен несколькими различными приемами, при условии, если материал монодисперсен. К таким приемам относятся методы измерения осмотического давления, светорассеяния, седиментационного равновесия и измерения скорости седиментации и диффузии. Все эти приемы основаны на различных принципах и часто дают не вполне совпадающие результаты. Это обьясняется тем, что получаемые данные зависят не только от размеров и массы, но и от электрического заряда, формы и степени гидратации белковых молекул. При измерении скорости движения частиц (например, скорости диффузии или скорости седиментации) хорошие результаты получаются только для тех молекул, форма которых близка к шарообразной, ибо они ведут себя в соответствии с изученными закономерностями. Отклонение от сферической формы (фибриллярные белки) и гидратация молекул приводят к различным ошибкам, так как движение молекул замедляется в результате увеличения коэффициента трения или эффективного размера частиц.
Интерпретация получаемых данных также сталкивается с рядом трудностей. Как уже говорилось, истинная величина молекулярного веса может быть определена различными приемами, если материал монодисперсен. Однако в природных белковых системах обычно содержатся молекулы, различающиеся по форме и величине. Эти различия обусловлены процессами обратимой ассоциации белковых частиц в растворе. Благодаря этому молекулярный вес, определяемый физико-химическими методами, представляет собой средний вес различных частиц, причем тип усреднения зависит от природы применяемого метода. Так, методом осмотического давления может быть определен так называемый среднечисленный молекулярный вес, являющийся средним арифметическим весом всех белковых частиц.
С помощью некоторых других методов можно получить совершенно иной вид среднего молекулярного веса. Например, изучение светорассеяния полидисперсных систем позволяет определить так называемый средневесовой молекулярный вес, равный сумме квадратов масс молекул, деленной на общую массу. Измерения седиментационного равновесия этих же систем приводят еще к одному виду средних величин, называемому Z-средним молекулярным весом (Mz), который равен сумме кубов масс молекул, деленной на сумму квадратов масс. Очевидно, что средневесовой и Z-средний молекулярные веса имеют большую величину, чем среднечисленный молекулярный вес, и что при переходе к ним большее значение приобретают молекулярные веса макрочастиц, нежели число составляющих их субъединиц.
Итак, значения среднего молекулярного веса зависят от метода, применяемого для его определения. В каждом конкретном случае эти значения могут быть весьма приближенными, поскольку во многих вычислениях недоучитывается форма молекулы. Здесь мы сталкиваемся с третьим видом информации, который может быть получен с помощью физико-химических методов, - определением основных размеров и формы белковой молекулы. Необходимо сразу же отметить, что проблема определения размера и формы частицы не может быть исчерпывающе решена с помощью указанных приемов. В лучшем случае для большинства белков можно лишь установить тип идеальной модели молекулы (эллипсоид вращения, цилиндр, стержень и т. н.) и ее основные параметры (например, соотношение продольной и поперечной осей). Очевидно, что реальные формы молекул несколько иррегулярны и не соответствуют ни одному из названных геометрических тел. Между тем во всех вычислениях предполагается, что диффундирующая, седиментирующая или иным способом движущаяся частица имеет правильные геометрические формы, поскольку более сложные формы вообще не поддаются расчету. Естественно, что это вынужденное допущение также может быть источником ошибок.
Наконец, полученные этими приемами результаты следует всегда рассматривать и с учетом происхождения выделенных белков и их высокой лабильности. При проведении серии исследований свойств белкового препарата может оказаться, что исследователь изучает при последнем анализе иные виды молекул, чем в начале работы. Более того, даже свежеприготовленные препараты могут в некоторых отношениях отличаться от присутствующих в исходной ткани белков. Насколько существенными могут быть эти различия? Дать какого-либо общего ответа на этот вопрос невозможно. В случае относительно стабильных белков, естественно существующих в свободном растворе (например, белки плазмы крови), можно сравнить результаты измерений в условиях, не слишком отличных от биологических, с результатами, полученными для очищенных систем. В других случаях сохранение оригинальной структуры в значительной степени доказывается способностью системы к воспроизводству in vitro своей биологической функции. Для таких структурных белков, как, например, коллаген, данные физико-химических измерений на изолированных белках необходимо дополнять прямыми электронно-микроскопическими наблюдениями тех биологических систем, в которых находятся эти белки. В некоторых же случаях почти невозможно установить, в какой степени очищенный белок является артефактом получения.
Все эти трудности и недостатки отдельных методов не могут, конечно, умалить их общей значимости в изучении строения белковой молекулы. Однако они должны напоминать о необходимости постоянного учета тонкости и сложности изучаемых белковых структур, несовершенства методов фракционирования и необходимости не только усовершенствования физико-химических методов, но и их комбинации с приемами изучения первичной структуры и методом рентгеноструктурного анализа.