Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968
Определение величины и формы белковых молекул
Скорость диффузии белков
Когда раствор белка находится в соприкосновении со свободным от белка растворителем, то происходит диффузия белковых частиц в растворитель. Скорость этого процесса можно выразить через количество белка, проходящее поверхность раздела в единицу времени, или, в дифференциальной форме, dm/dt. Очевидно, что скорость диффузии должна быть пропорциональна площади поверхности раздела А и градиенту концентрации белка в направлении диффузии dc/dx, т. е.
где D — коэффициент пропорциональности, называемый коэффициентом диффузии, который определяется особенностями данного белка и растворителя, а также температурой. Естественно, он тем выше, чем меньше размер молекул белка, вязкость растворителя η и чем больше температура Т. Для шарообразных молекул, размер которых характеризуется одним показателем — радиусом r, эта зависимость выражается формулой
где N — число Авогадро, a R — газовая постоянная. Коэффициент диффузии белков — величина порядка 10-6—10-7 см2∙сек-1 а аминокислот — 10-5 см2∙сек-1. Поскольку молекулярный вес шарообразной частицы белка равен объему шара с радиусом r, помноженному на плотность частицы а и число Авогадро, то формула (9) может быть преобразована в следующую
Таким образом, зная коэффициент диффузии и плотность белковой частицы, можно определить ее молекулярный вес.
Вместе с тем полученные экспериментально значения коэффициента диффузии могут быть использованы и для определения формы молекулы — в частности, для расчета соотношения ее осей. Поскольку молекулы белка в большей своей части не являются шарообразными, они перемещаются при диффузии медленнее, чем шарообразная молекула того же молекулярного веса. В этом случае по формуле (9), подставив найденный экспериментально коэффициент диффузии, можно рассчитать «кажущийся» радиус r белковой частицы. С другой стороны, определив другими методами молекулярный вес данного белка, можно рассчитать r0 — радиус идеальной шарообразной частицы с той же плотностью по формуле
Где 
— объем отдельной молекулы. Нешарообразную молекулу белка можно приближенно описать как эллипсоид вращения. Поэтому, установив отношение «кажущегося» радиуса к идеальному r/r0, можно по специальным формулам рассчитать соотношение b/a, где b — экваториальная полуось эллипсоида и а — полуось вращения. Для вытянутых эллипсоидов b/а оказывается меньше 1, для сплющенных — больше 1.
Экспериментально постоянную диффузии определяют путем измерения скорости размывания четкой границы раздела, созданной в вертикальной кювете между белковым раствором и растворителем. Это измерение проводят путем регистрации изменения градиента показателя преломления с последующим расчетом градиента концентрации, поскольку они связаны линейной зависимостью.
Однако создать четкую границу раздела между двумя растворами очень трудно. Поэтому чаще оба раствора разделяют пористым диском, и скорость диффузии оценивается путем измерения количества белка, прошедшего через единицу площади за определенное время. Диффузионный сосудик калибруется при помощи раствора белка, коэффициент диффузии которого известен. Если молекулярный вес этого белка М1 и коэффициент диффузии D1, то молекулярный вес неизвестного белка М2 можно определить по формуле
При равенстве «кажущихся» радиусов (r1 и r2) и плотности частиц (σ1 и σ2) формула значительно упрощается:
Молекулярные веса, рассчитанные из скоростей диффузии, дают величины того же порядка, что и значения, полученные другими методами. Правда, отклонения от шарообразной формы и гидратация молекул, сказывающиеся на скорости диффузии, приводят к тому, что этот метод редко используется для прямого расчета молекулярных весов. Чаще он сочетается с методом скорости седиментации.