Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968
Определение величины и формы белковых молекул
Вязкость белковых растворов
Хотя измерения вязкости белковых растворов не дают непосредственно знаний размера и формы макромолекулы, этот метод является одним из простейших приемов изучения молекулярных параметров. По результатам измерения вязкости растворов эллипсоидальных и стержневых молекул оказывается возможным вычислить отношение длины молекул к их толщине, а для фибриллярных белков определить и их абсолютные размеры. С другой стороны, вязкость разбавленных растворов белка является функцией их молекулярного веса. Правда, определить молекулярный вес по одним лишь данным о вязкости нельзя. Однако можно установить прямое соответствие между молекулярным весом, определенным другими методами, и вязкостью. Наконец, измерения вязкости особенно наглядно показывают изменения в молекулярной структуре, происходящие при денатурации белковых молекул, их агрегации или разъединении на субъединицы.
Вязкость есть мера сопротивления сдвигу в жидкости, и ее можно рассматривать как один из видов внутреннего трения. Если слой движущейся жидкости благодаря внутреннему трению сообщает движение прилегающему к нему слою, то сила, необходимая для поддержания такого движения, пропорциональна площади слоев и градиенту скорости между ними:
т = η ∙ g (14)
где т — напряжение сдвига (напряжение сдвига есть тангенциальная сила, необходимая для поддержания относительного движения, приходящаяся на единицу поверхности между соседними слоями), g — градиент скорости, или скорость сдвига и η — фактор пропорциональности, именуемый коэффициентом вязкости жидкости. Вместо термина «коэффициент вязкости» пользуются обычно термином вязкость. Единицей вязкости в системе CGS является пуаз (nз), или г/см∙сек.
Определение вязкости проводят с помощью различных вискозиметров, простейшим из которых является вискозиметр Оствальда (рис. 34). Водному раствору дают стечь из пипетки 3 через капилляр 4 и определяют время, необходимое для того, чтобы мениск опустился от точки 1 до точки 2. Если вязкость белкового раствора не слишком сильно отличается от вязкости воды и если диаметр капилляра подобран правильно, то вязкость ц прямо пропорциональна времени вытекания t и плотности жидкости d:
η = С ∙ t ∙ d, (15)
где С—константа, зависящая от размеров вискозиметра.
Часто вместо этого уравнения применяют преобразованную форму
где v — так называемая кинематическая вязкость (η носит название динамической вязкости). Таким образом, кинематическая вязкость пропорциональна времени истечения; единицей кинематической вязкости принят стокс (ст.) 1 ст равен 1 см2/сек. Если η0 — вязкость воды, а η — вязкость белкового раствора, то относительная вязкость равна
Рис. 34. Вискозиметр Оствальда (из Гауровица, 1965). Пояснения в тексте.
Видно, что относительная вязкость не зависит от постоянной С, являющейся функцией диаметра капилляра. Поскольку вязкость белкового раствора всегда больше вязкости воды, то относительная вязкость будет всегда больше единицы. Разница между этой величиной и единицей носит название удельной вязкости и представляет собой долю вязкости, связанную только с молекулами растворенного вещества:
При высоких концентрациях раствора между частицами растворенного белка возникают взаимодействия, особенно сильные для нитчатых молекул; поэтому для характеристики макромолекул измерения вязкости необходимо вести в очень разбавленных растворах. Поскольку же вязкость разбавленных растворов очень мало отличается от вязкости воды, то поступают следующим образом. Вязкость измеряют при нескольких значениях концентрации, рассчитывают каждый раз величину
ηуд/c и строят график зависимости этой величины от с. Экстраполяцией находят значение ηyд/с при с = 0. Это экстраполированное значение носит название характеристической вязкости [η], если концентрация выражается в г/100 мл, или предельного числа вязкости [η], если концентрация выражается в г/мл:
Термин «характеристическая вязкость» не точен; [η] не есть в сущности вязкость и не имеет размерности этой величины, а есть величина, пропорциональная объему, занятому в растворе молекулами растворенного вещества. Для пояснения этого необходимо остановиться на понятии «инкремент вязкости».
Эйнштейн теоретически рассчитал, что вязкость для очень разбавленных растворов шарообразных частиц определяется формулой:
где N — число частиц, v — объем частицы и V — общий объем раствора. Выражение Nv/V = Ф выражает объемную долю частиц белка в растворе. Преобразуя уравнение, получаем:
ηуд = 2,5Ф. (21)
Несколько позже это уравнение было обобщено Симхой для эллипсоидальных частиц
где η — инкремент вязкости*, который для шарообразных частиц глобулярных белков равен 2,5. Поскольку характеристическая вязкость [η] выражается через весовую концентрацию, а инкремент вязкости — через объемную, то эти величины связаны между собой соотношением
где 
— парциальный удельный объем при бесконечном разбавлении, т. е. приращение объема раствора при добавлении весовой единицы безводного белка к достаточно большому объему растворителя. Величина 
варьирует у белков в пределах 0,69 — 0,75.
Инкремент вязкости зависит от отношения осей эллипсоида вращения. Для вытянутых частиц с отношением осей f = a/b > 1,5 зависимость от f определяется формулой
* Инкремент вязкости часто обозначают через v. Однако мы воспользовались другим обозначением, чтобы не смешивать его с обозначением кинематической вязкости, приведенным ранее.
Для сплющенных эллипсоидов λ равна 1,5, для вытянутых — 1,8. Таким образом, зная [η] и v, легко рассчитать инкремент вязкости и осевое соотношение, т. е. определить форму молекулы. Вместе с тем характеристическая вязкость может быть использована и для подсчета молекулярного веса. Основываясь на измерении полимеров со средней и малой длиной цепи, Штаудингер установил, что
N = КМ, (24)
где К — постоянная, зависящая от особенностей полимера и растворителя. Она может быть определена приблизительно путем измерения [т,] для белка с известным молекулярным весом.
На основании более точных измерений было показано, что определению молекулярного веса нитевидных частиц лучше отвечает Формула
[η] = KMa, (25)
где а имеет значение от 0,5 до 1,5. Основная трудность определения молекулярного веса по вязкости состоит в том, что указанное количественное соотношение между ними устанавливается только на гомогенных по молекулярному весу препаратах. Кроме того, при измерении вязкости растворов белков с нитевидными молекулами следует иметь в виду явление так называемой тиксотропии. Оно состоит в том, что при стоянии достаточно концентрированный раствор белка (такого, например, как актин) переходит в желеобразное состояние. В исходное состояние его можно перевести простым встряхиванием.