Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968
Определение величины и формы белковых молекул
Рассеяние света белковыми растворами
Коллоидные растворы рассеивают часть падающего света — опалесцируют. Это явление называется эффектом Тиндаля. В растворах небольших молекул светорассеяние незначительно, хотя даже жидкости и газы рассеивают небольшую часть падающего света. Рассеяние света происходит благодаря тому, что под влиянием быстро меняющегося электрического поля световой волны молекулы становятся колеблющимися электрическими диполями, которые посылают колебания по всем направлениям. Чем больше размер молекулы и величина дипольного момента, тем больше светорассеяние.
Ecли размеры молекулы не превышают 1/20 длины волны света, то такие молекулы рассеивают свет равномерно. В этом случае интенсивность светорассеяния можно определить путем измерения интенсивности Rθ света, рассеянного иод углом θ по отношению к направлению падающего пучка света. Величина Rθ называется отношением Рэлея и определяется уравнением
(26)
где I0 — интенсивность падающего света, Iθ — интенсивность светорассеяния в направлении 0 и r — расстояние от рассеивающей среды до наблюдателя. Обычно измеряют интенсивность света, рассеянного под углом 90°. Если падающий свет неполяризован, а молекулы растворенного вещества малы (1/20 λ), то зависимость между Rθ и R90 выражается простым отношением
R0 = R90 ∙ (1 + cos2 θ). (27)
В белковом растворе рассеянный свет имеет большую интенсивность, чем в чистом растворителе. Эта разница в интенсивности светорассеяния называется мутностью раствора и обозначается через т. Связь между мутностью и интенсивностью света, рассеянного под углом 90°, определяется уравнением
Мутность белковых растворов пропорциональна числу и размерам белковых молекул, что хорошо видно из следующей формулы:
где с — концентрация белка (г/мл), а Н — коэффициент пропорциональности. Измерив показатели преломления чистого растворителя (nа) и белкового раствора (n) и зная длину волны падающего света (λ), можно рассчитать этот коэффициент по формуле
Сопоставив уравнения (29) и (30), можно заключить, что величина мутности зависит не только от размера и числа белковых молекул, но также от длины волны падающего света и разности показателей преломления растворителя и белкового раствора.
Вышеприведенное уравнение справедливо только для идеальных систем, в которых нет взаимодействия между молекулами. Поэтому для интерпретации экспериментальных данных в него необходимо ввести константу взаимодействия В (мера «эффективного объема» молекул):
Если отложить графически зависимость Нс/т от с, то тангенс наклона кривой даст величину В, а отрезок, отсекаемый от оси ординат, — величину 1/М.
Если мутность белкового раствора по каким-либо причинам не может быть измерена, то молекулярный вес можно определить и непосредственно по интенсивности рассеянного света (R90) по аналогичной формуле:
где К — коэффициент, объединяющий все оптические константы (длину волны, показатель преломления, инкремент показателя преломления). Так как все величины формул могут быть определены экспериментально, то молекулярный вес можно установить сравнительно легко и быстро. Однако для этого метода растворы должны быть тщательно очищены от пыли и взвешенных частиц, а также от примеси сильнорассeивающих веществ (например, следов полисахаридов). Необходимо также, чтобы в процессе измерения не происходило агрегации или денатурации белковых молекул. Полученные этим методом молекулярные веса сывороточного и яичного альбуминов были равны соответственно 74 000 и 45 000, что хорошо совпадает с результатами других методов.
Все изложенное выше относится к случаю, когда размеры рассеивающих молекул менее 1/20 длины световой волны. При этом они равномерно рассеивают свет. Интенсивность света, рассеянного, в частности, под углами 45 и 135° (R45 и R135), будет одна и та же. Если же размеры белковой молекулы настолько велики, что сравнимы с длиной волны падающего света, то свет, рассеянный одной частью молекулы, может не совпадать по фазе со светом, рассеянным другой ее частью. Возникающая внутренняя интерференция приводит к тому, что интенсивность рассеянного света распределяется несимметрично относительно направления, перпендикулярного пучку падающего света. В результате интенсивности R45 и R135 оказываются неодинаковыми. Отношение q = (R45/R135) — 1 носит название коэффициента диссимметрии. С увеличением разбавления q приближается к предельному значению, называемому характеристическим коэффициентом диссимметрии. Эта величина есть функция отношения некоторого абсолютного размера молекулы (точнее — модели молекулы) к длине волны света, и ее можно использовать для непосредственных определений размеров таких больших частиц, как, например, вирусные.
Интенсивность светорассеяния обычно измеряется с помощью чувствительных фотоумножителей, смонтированных на держателе, который может перемещаться по окружности относительно центра системы. В центре находится кювета с раствором белка, которая имеет полуоктагональную форму, с плоскими окошечками в направлении падающего пучка света, а также под углами 45, 90 и 135° (рис. 35). Рассеянный свет направляется на фотоумножитель и регистрируется с помощью гальванометра. Для перевода результатов этих измерений в абсолютные значения интенсивности светорассеяния прибор предварительно калибруется с помощью блоков из органического стекла или суспензий селикателя.
С помощью метода светорассеяния удалось не только удовлетворительно определить молекулярные веса ряда глобулярных и фибриллярных белков и вирусов, но и изучить кинетику таких быстротекущих процессов, как агрегация яичного альбумина, полимеризация фибриногена, взаимодействие ртути с меркаптоальбумином и т. II.
Рис. 35. Схема прибора для измерения интенсивности светорассеяния (из Степса, 1963):
1 — источник света, 2 — линзы, 3 — фильтр, 4 — щель, 5 — кювета, 6 — фотоумножитель, 7 — светонепроницаемый кожух.