Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Электрохимия белков. Взаимодействие белков с водой
Аминокислоты как диполи. Ионизация аминокислот

Аминокислоты являются амфотерными электролитами, содержащими как амино-, так и карбоксигруппы. Благодаря этому они могут образовывать соли и с кислотами, и с основаниями. В водных растворах они могут существовать либо в виде нейтральных молекул H₂N—R—СООН, либо в виде диполей H₃N—R—СОО^-. Какая из этих форм соответствует действительности длительное время было неизвестно. Между тем установление истинной формы аминокислот имело большое значение как для понимания механизмов их взаимодействия с кислотами и щелочами, так и для определения констант диссоциации карбоксильных и аминогрупп.

Впервые предположение о дипольном строении аминокислот было высказано в 1916 г. Адамсом и несколько позже Бьеррумом. Это предположение не могло быть проверено непосредственно опытами по изучению электропроводности их растворов, ибо при нейтральном pH молекулы аминокислот не перемещались в электрическом поле. Доказательства дипольного строения аминокислот были получены на основе изучения диэлектрической постоянной их растворов, явления электрострикции, определения констант и теплот ионизации.

Хорошо известно, что при растворении в воде неполярных соединений ее диэлектрическая постоянная уменьшается. При растворении же аминокислот она увеличивается, причем это увеличение (диэлектрический инкремент) достигает 23—35%. Такое увеличение можно объяснить только дипольным строением молекул аминокислот. Это заключение хорошо подтверждается явлением электрострикции, т. е. значительным уменьшением парциального моляльного объема (см § 5) аминокислот по сравнению с объемом незаряженной изомерной молекулы. Уменьшение объема достигает порядка 13 см³/моль, если аминогруппа находится в a-положении к карбоксилу, и 15 см³/моль — если она находится в ß-положении. Явление электрострикции обусловлено ориентацией и плотной упаковкой части молекул воды вокруг ионных групп аминокислот и сопровождается уменьшением теплоемкости и сжимаемости растворов биполярных ионов.

Существенным подтверждением дипольного строения аминокислот явилось определение теплоты ионизации их карбоксильной и аминной групп. Напомним, что теплота ионизации определяется числом калорий на 1 моль, поглощенных при реакции ионизации в условиях постоянства температуры и давления. При соответствующих определениях было найдено, что теплота ионизации аминокислот в кислых растворах составляла в среднем около 0,5 ккал/моль и в щелочных растворах — около 11 — 12 ккал/моль. Эти величины очень близки к теплотам ионизации алифатических карбоновых кислот и аминов (в среднем 1 ккал/моль и 12 ккал/моль соответственно) и говорят о том, что кислота реагирует с карбоксильными группами аминокислот, а щелочь — с их основными группами.

Таким образом, ионы водорода реагируют не с Н₂N-группой превращая ее в группу а с группой СОО^-. И наоборот, гидроксильные ионы реагируют не с карбоксильной группой, а с группой

В результате аминокислоты в кислой среде находятся в виде катионов, а в щелочной — в виде анионов.

О том, что и твердые аминокислоты существуют, вероятнее всего, в форме диполей, свидетельствуют их значительная плотность и высокие точки плавления. Оба эти свойства указывают на сильное электростатическое притяжение между противоположно заряженными ионизированными группами смежных молекул, в результате чего их оказывается значительно труднее разделить, чем смежные нейтральные молекулы.

Новое представление о дипольном строении аминокислот позволило правильно рассчитать константы диссоциации, их кислых и основных групп. При расчете констант на основе старых уравнений получались величины, которые значительно отличались от постоянных диссоциации алифатических карбоновых кислот и аминов. Так, константа диссоциации для кислых групп была рассчитана равной ~10^-9 и для аминогруппы — ~10^-11, в то время как для уксусной кислоты она составляет 1,8 ∙ 10^-5 и для этиламина 1,2 ∙ 10^-13. Эти противоречия устраняются, если принять дипольную форму аминокислот.

Прежде чем перейти к рассмотрению диссоциации кислых и основных групп аминокислот, необходимо коротко остановиться на теории кислот и оснований Брёнстеда и на понятии константы диссоциации? Согласно Бренстеду, кислотой называются все те вещества, которые способны отдать протон, а основанием — все те, что способны его связать. С этой точки зрения ионизацию простой кислоты и константу диссоциации можно выразить следующим образом:

где НА — кислота, А^- — основание, К₁ — константа диссоциации кислоты, а — активности, — коэффициенты активности ионов и — коэффициент активности недиссоциированной кислоты. В случае разбавленных растворов коэффициенты активности близки к единице и активности кислоты, основания и ионов водорода заменяются их молярными концентрациями. Логарифмируя обе части уравнения (49), получим

где pН = — lg [Н⁺] и pK₁ = — lgK₁.

При термодинамическом равновесии концентрации обеих форм слабой кислоты будут равны, т. е. концентрация донора протонов НА будет равна концентрации акцептора протонов А^-. В этих условиях константа диссоциации кислоты будет равна концентрации ионов водорода, которая и будет мерой диссоциации кислоты, а величина рК₁ будет соответственно равна pH раствора:

Говоря иными словами, константа диссоциации кислоты указывает нам ту концентрацию протонов, при которой отношение концентраций обеих форм кислоты равно единице, т. е. рК₁ равно тому pH. при котором 50% кислоты находится в диссоциированной и 50%—в недиссоциированной форме.

При рассмотрении аминокислот с точки зрения теории Брёнстеда группы СООН и H₃N следует считать кислотами, а группы СОО^- и H₂N — основаниями. Соответственно ионизацию карбоксильной и аминной групп и константы диссоциации этих групп (К₁ и К₂) можно выразить следующими уравнениями:

Рас. 42. Кривая диссоциации глицина (по Майстеру, 1961).

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что константы диссоциации К₁ или К₂ (показатели рК₁ или рК₂) численно равны концентрации водородных ионов (значениям pH), при которой отношение

равно единице, т. е.

50% аминокислоты находится в виде диполей, а 50% — в виде катионов или анионов. Для основной массы аминокислот величины К₁ и К₂ рассчитанные из уравнений (53) — (56), оказались равными приблизительно 10^-2—10^-3 и 10^-9—10^-10 соответственно (рК₁ приблизительно равно 2—3 и рК₀ —9—10). Более высокие значения К₁ по сравнению с константой ионизации уксусной кислоты (1,8∙10^-5) обусловлены присутствием группы NH₃, усиливающей ионизацию карбоксильной группы. Точные значения этих постоянных, равно как и значения констант диссоциации боковых групп (рК₃) даются в табл. 6) Величины рК₁ и Кр₂ можно определить с помощью этектрометрического титрования. Кривая титрования глицина соляной кислотой и едким натром представлена на рис. 42. Видно, что в точке, соответствующей pH 2,34, одна молекула кислоты отдает 0,5 эквивалента ионов водорода. Следовательно, в этой точке мы имеем 50% аминокислоты в виде диполя и 50% —в виде катиона, и рK₁ для глицина равен 2,34. В точке, соответствующей pH 9,6, аминокислота поглощает 0,5 эквивалента ионов Н⁺; здесь 50% аминокислоты находится в виде аниона (МН₂—R—СОО-) и 50% —в виде диполя, т. е. рК₂ = 9,6. Таким образом, значения р/С будут равны тому значению pH, которое на кривой титрования соответствует 0,5 эквивалента кислоты или щелочи, связываемого одной молекулой аминокислоты.

Таблица 6 Значения констант диссоциации и изоэлектрической точки аминокислот, обычно встречающихся в белках

Кривые диссоциации тех аминокислот, молекулы которых содержат более двух диссоциирующих групп, имеют дополнительные точки перегиба. Например, для гистидина имеются перегибы не только при pH 1,82 (pK₁) и pH 9,17 (рК₂), но и при pH 6,0 (рK₃, имидазол).

Изоэлектрической точкой аминокислоты (рI) называется то значение pH, при котором молекула электронейтральна; при этом значении не происходит передвижения аминокислоты в электрическом поле. Изоэлектрическую точку для моноаминомонокарбоновых кислот можно найти путем деления суммы pK₁ и рК₂ на 2. Если бы степень ионизации карбоксильной и аминогруппы была одинакова, то изоточка моноаминомонокарбоновых аминокислот лежала бы в нейтральной среде. Но так как ионизация карбоксильной группы оказывается выше, чем ионизация аминогруппы, то эти кислоты являются слабокислыми веществами, изоэлектрическая точка которых лежит около pH 6,0. У дикарбоновых кислот и диаминокислот изоэлектрические точки лежат соответственно в кислой и щелочной среде, точные значения рI для отдельных аминокислот даны в табл 6.