Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953
Роль белков в реакциях иммунитета
Соединение антигена с антителом
В основе всех иммунологических реакций лежит один и тот же первичный процесс соединения антигена с антителом. Преципитация, агглютинация, цитолиз и другие более сложные реакции являются вторичным выражением этого процесса. Самой простой из всех реакций антигена с антителом является реакция преципитации растворенного антигена соответствующим антителом. Используя антигены, содержащие окрашенные группы, изотопы или какие-нибудь легко определимые химическим путем элементы, можно провести количественный анализ преципитата и установить его состав при различных условиях. Подобные исследования были проведены многими авторами, использовавшими такие меченые антигены, как гемоглобин, иодированные белки, фосфопротеиды, азобелки и гемоцианин.
Первые анализы такого рода были проведены By [93]. Исследования с применением более усовершенствованных методов показали, что отношение антитело/антиген в преципитате увеличивается с увеличением этого отношения в смеси антитела с антигеном перед преципитацией [46, 94—96]. Отношение антитело/антиген в преципитате зависит от величины частиц используемого антигена [97]. Если преципитирующим антигеном служит клетка, то слой молекул антитела, связанный с ее поверхностью, очень мал по сравнению с объемом клетки. Иная картина наблюдается в том случае, если в качестве антигена используются вещества, имеющие молекулы малого размера; в некоторых преципитатах только 2—3% осадка образовано антигеном, а основная масса преципитата состоит из антител.
Зная молекулярные веса антигена и антитела, можно вычислить молекулярное отношение антитело/антиген в преципитате.
Фиг. 50. Соединение молекул антигена (черные) с молекулами антитела (белые).
А — образование комплекса антиген—антитело между поливалентным антигеном и одновалентным антителом (антитело взято в избытке); Б — образование преципитатов при неспецифической агрегации комплексов антиген-антитело; В — растворимый комплекс при избытке антигена.
Это отношение иногда очень высоко. Так, например, в преципитате тиреоглобулин—антитиреоглобулин содержится 60 молекул антитела на 1 молекулу тиреоглобулина [98]. Арсанилазоглобулин способен связывать около 50 молекул антитела на каждую молекулу антигена [95]. Можно себе представить, что в самом простом случае комплекс антиген—антитело состоит из 1 молекулы антигена, исполняющей роль ядра и находящейся в центре комплекса, и присоединенных к ней многочисленных молекул антитела (фиг. 50). Когда образовавшиеся комплексы достигают известной величины, они становятся неустойчивыми и образуют нерастворимые агрегаты, подобно тому как это происходит с молекулами эдестина и эвглобулина. Надо также отметить, что образование указанных агрегатов тормозится теми же агентами, которые тормозят и образование агрегатов глобулинов, т. е. нейтральными солями, кислотами и основаниями [95]. Нингидрин и некоторые другие неспецифические реактивы способствуют преципитации [99].
Преципитаты, состоящие из комплекса антиген—антитело, обычно растворяются в избытке антигена. Это приписывается образованию множества маленьких комплексов, содержащих только по 1 молекуле антитела на каждую молекулу антигена [81] (см. фиг. 50). Преципитаты, образованные антителами лошади, растворяются в избытке этих антител. В отличие от них преципитаты, образованные антителами кролика, не растворяются в избытке соответствующей кроличьей антисыворотки. Результаты этих исследований оказались особенно неожиданными в тех случаях, когда для иммунизации был использован чужеродный сывороточный глобулин. В этих случаях как антиген, так и антитело являются сывороточными глобулинами, обладающими очень сходными физико-химическими свойствами. Столь значительное различие между действием антител лошади и действием антител кролика указывает на то, что между этими двумя типами антител имеется существенная разница. Неспособность антител кролика растворять преципитат некоторые авторы объясняют одновалентностью этих антител. Можно полагать, что одновалентные антитела кролика неспособны соединяться более чем с 1 молекулой антигена и не могут поэтому образовывать каркас из последовательно чередующихся единиц антиген—антитело. Образование такого каркаса, по мнению этих авторов, является характерным для поливалентных антител. Различие между каркасом, образуемым поливалентными антителами и агрегатами одновалентных антител, показано на фиг. 50. Оно заключается в основном в том, что в агрегате, образованном одновалентными антителами, комплексы антиген—антитело соединяются друг с другом при помощи неспецифических связей [100], тогда как образование каркаса происходит только при помощи специфических связей. Различие между этими двумя типами стирается, когда мы имеем дело с такими преципитатами, как тиреоглобулин—антитиреоглобулин, где на каждую молекулу тиреоглобулина приходится приблизительно 60 молекул антитела. Очевидно, что в подобном случае только очень немногие из связей, образующих пространственную решетку, могут быть специфичными. Поскольку преципитаты антиген—антитело, образованные антителами лошади, растворяются в избытке антител [101, 102], можно думать, что антитела лошади поливалентны. Необходимо, однако, отметить, что свойства антител лошади могут в значительной степени зависеть от способа иммунизации [101].
Как видно из изложенного, вопрос о валентности антител еще окончательно не разрешен. Что же касается вопроса о валентности антигена, то нет никаких сомнений в том, что молекулы антигена поливалентны, т. е. что они имеют несколько групп, с которыми может соединяться антитело. Это доказывается тем, что низкомолекулярные гаптены, молекулы которых содержат только по одной детерминирующей группе, неспособны образовывать преципитат с антителами, направленными против этих групп. Преципитаты образуются, однако, некоторыми двухвалентными или трехвалентными гаптенами [103]. Гаптен, имеющий группы R и X, преципитируется только смесью анти-R и анти-Х, но ни одним из этих антител в отдельности (R обозначает n-азофенилазофениларсоновую кислоту, X — n-азофенилазобензойную кислоту) [104]. Интерпретация этих экспериментов представляет большие трудности, ввиду того что некоторые из гаптенов могут образовывать агрегаты, состоящие из большого числа молекул и обладающие вследствие этого несколькими детерминирующими группами [105, 106].
Образование нерастворимого преципитата зависит не только от числа реактивных групп в молекулах антигена и антитела, но также от пространственного расположения этих групп, от их полярности и от гидрофильных или гидрофобных свойств [107]. Ясно, что антитела могут соединяться только с такими группами антигена, которые расположены на поверхности молекулы антигена, но не с эндогруппами, расположенными внутри ее [95].
Были сделаны попытки вскрыть сущность реакции между антигеном и антителом, применяя закон действующих масс [108]. Главная трудность, с которой столкнулись при этих попытках, заключается в том, что реакция между антигеном и антителом обратима только частично. Некоторые преципитаты не растворяются в избытке антигена, хотя такой избыток и тормозит само образование преципитата [109]. Если обозначить молекулу антигена через G, а молекулу антитела через В, то реакцию между антигеном и антителом можно представить в следующем виде [83]:
В последующих фазах могут протекать реакции типа 2GB3→G2B6 или же образование кольцевых структур в связи с соединением цепей «конец с концом» [110]. Если агрегаты антиген—антитело соединяются друг с другом при помощи неспецифических связей, то при этом возникают связи типа В—В. В некоторых случаях наличие подобных неспецифических связей было подтверждено образованием смешанных агглютинатов, состоящих из нескольких различных пар антиген—антитело. Подобная коагглютинация, однако, не представляет общего явления [ПО]. Присоединение вирусных частичек к поверхности молекул антитела оказалось возможным наблюдать при помощи электронного микроскопа [111].
Взаимодействие между антигеном и антителом осуществляется посредством электростатических сил, возникающих между полярными группами. Этот вопрос уже рассматривался в гл. X, причем было подчеркнуто, что эти силы действуют только на очень небольших расстояниях, так как интенсивность их действия падает пропорционально г6, т. е. пропорционально шестой степени расстояния между обоими полюсами [112]. Хотя сила, с которой действует каждая полярная группа, очень слаба, общая сила взаимодействия может достигать значительной величины, если одновременно взаимодействует большое число полярных групп. Это возможно только в том случае, если полярные группы расположены на двух больших молекулах, конфигурации поверхностей которых геометрически дополняют друг друга. Расстояние между поверхностями антигена и антитела составляет около 4 Å, в связи с чем изменение даже в 0,1 Å значительно влияет на силу взаимного притяжения. Это делает понятным, почему то небольшое различие, которое существует между o-, м- и n-производными одного и того же соединения, имеет в высшей степени существенное значение для взаимного притяжения молекул антигена и антитела [113].
Изменение свободной энергии, сопровождающее связывание гаптена с антителом, равно примерно 1510 кал/моль [114]. При прямом калориметрическом определении тепла, выделяемого в результате реакции между гемоцианином и антигемоцианином, была найдена величина порядка 3 кал на 1 г азота, т. е. 40 000 кал на 1 моль связанного антитела [115].
Преципитация тормозится высоким давлением [116]. Это указывает на то, что связывание антигена с антителом сопровождается выделением воды. Частичной дегидратации, повидимому, подвергаются как молекулы антигена, так и молекулы антитела на том участке, где они непосредственно соприкасаются друг с другом. В результате этого два мономолекулярных слоя воды, которые первоначально окружали каждый из реагирующих компонентов, замещаются одним общим для обоих компонентов слоем. Изменение свободной энергии реакции GBn→GBn-1 + В можно вычислить, зная постоянную равновесия К, по уравнению Вант-Гоффа:
∆F = — RTlnK.
Для реакции GB8→GB7 + В величина ∆F была найдена равной 9 800 кал на 1 моль антитела (G — сывороточный псевдоглобулин овцы, комплексированный с анилин-м-сульфоновой кислотой, а В — соответствующее антитело) [117].
Ряд исследований посвящен изучению реакции между антителом и антигеном в мономолекулярних слоях. Если яичный альбумин адсорбировать на поверхности хромовой пластинки и погрузить затем эту пластинку в раствор антитела, то на поверхности антигена образуется мономолекулярний слой антитела [118]. Однако при обратном процессе, т. е. при адсорбции на металле антитела и погружении пластинки в раствор антигена, отложения антигена на поверхности слоя антитела не происходит [118]. Используя подобную методику, можно приготовить пленки, в которых будут чередоваться слои токсина и антитоксина [119]. Сообщения [120] о том, что антиген и антитело соединяются при помощи сил, действующих сквозь пластические пленки на расстоянии свыше 100Å, повидимому, являются ошибочными. Ошибка, по всей вероятности, обусловлена диффузией реагирующих частичек через трещины или поры этих пластинок [121, 122].
Поскольку и антигены, и антитела являются белками, реакция, происходящая между этими двумя соединениями, тормозится всеми теми факторами, которые действуют на белковые молекулы. Поэтому ошибочные результаты получаются, если реакция проводится не при нейтральном pH [92] или если в качестве антисептика используют мертиолат 1 и другие подобные соединения [123], а также и в тех случаях, когда антиген маскируется другими коллоидами. Так, например, преципитация вируса антивирусом становится невозможной после нагревания вируса с сывороточным альбумином [124]; если же затем разрушить пепсином слой сывороточного альбумина, защищающий частицы вируса, то вирус снова приобретает способность осаждаться соответствующей антисывороткой.
1 Органическое ртутное соединенно, обладающее антисептическими свойствами. — Прим. ред.