Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Методы выделения, очистки и определения белков
Методы выделения

Обычные методы органической химии, применяемые для изолирования органических соединений, непригодны для выделения белков ввиду того, что большинство белков необычайно чувствительно к нагреванию, к действию кислот, оснований, органических растворителей и в некоторых случаях даже к действию дестиллированной воды. Нерастворимые клеточные белки можно легко получить после экстрагирования из клеток жиров, углеводов и растворимых белков водой и органическими растворителями. Часто экстрагирование проводят также разведенными растворами NaCl или бикарбоната натрия, так как некоторые белки растворимы только в присутствии нейтральных солей.

Если нерастворимый белок устойчив к протеолитическим ферментам, дальнейшая его очистка достигается действием пепсина при pH 1—2 или трипсина при pH 8—9. Таким путем можно получить, например, кератин — нерастворимый белок волос, ногтей, эпидермиса и шерсти.

Кератин, коллаген, фиброин и подобные им нерастворимые белки нельзя очистить путем кристаллизации. Поэтому у нас нет уверенности, что выделенные обычными методами препараты этих белков являются индивидуальными белками, а не смесью нескольких различных белков.

Выделение и очистка растворимых белков производится путем экстрагирования их из клеток соответствующими растворителями с последующим осаждением, которое достигается либо изменением концентрации солей или водородных ионов, либо путем добавления органических соединений. Во многих случаях этими способами можно получить кристаллические препараты белков.

Ввиду того что многие белки в растворе могут денатурироваться даже при комнатной температуре, всю процедуру выделения белка, во избежание его денатурации, нужно вести при низких температурах. Особенно неустойчивы растворы белков в дестиллированной воде. При добавлении нейтральных солей скорость денатурации белков уменьшается; так, например, кристаллический трипсин можно хранить в насыщенном растворе сульфата натрия [1]. Скорость денатурации уменьшается также, если хранить белковый раствор при пониженной температуре. Для получения препаратов нативных белков необходимо поэтому иметь в лаборатории рефрижераторы, центрифуги с охлаждением и холодные комнаты. При низких температурах уменьшается и вторая опасность — возможность бактериального разложения белка. Белковые растворы представляют собой прекрасную питательную среду для бактерий и неизменно подвергаются, если их хранить при комнатной температуре, заражению бактериями, разрушающими белки. Вследствие термолабильности белков их растворы нельзя стерилизовать нагреванием. Рост бактерий можно затормозить путем добавления антисептиков, однако некоторые антисептики вступают в соединение с белками и, таким образом, изменяют их физико-химические свойства. Кроме того, большинство обычных антисептиков способны вызвать денатурацию белков и поэтому не могут быть использованы при получении препаратов нативных белков. Бактерии можно удалить из белковых растворов центрифугированием при больших скоростях или фильтрованием через фильтры Зейтца, Беркефельда или через бумажную массу (мязгу). Неудобство фильтрования заключается в том, что при этой процедуре возможны частичные потери белка за счет денатурации, вызываемой адсорбцией его на пористой поверхности фильтра [3]. Так, например, при измерении электрокинетического потенциала при помощи стеклянного электрода происходит адсорбция глиадина па пористой стеклянной мембране [3].

Самый лучший способ длительного хранения белковых растворов состоит поэтому в том, чтобы хранить их в замороженном состоянии, примерно при —10°. Так как при этой температуре бактерии не могут размножаться, то стерилизация раствора становится излишней. В лаборатории автора растворы антител и ферментов хранятся в замороженном состоянии в течение многих месяцев, а некоторые — в течение многих лет без какой-либо заметной потери биологической активности. Однако из этого общего правила имеются исключения; например, некоторые из испытанных растворов антител теряли свою активность при повторном оттаивании и замораживании, несмотря на то, что температура никогда не поднималась выше 0° [4]. Липопротеины также денатурируются при замораживании и оттаивании [2]. Наоборот, при замораживании и последующем оттаивании зимазы наблюдается увеличение ее активности, обусловленное, по всей вероятности, дезагрегацией частичек фермента в растворе [5]. С другой стороны, было найдено, что растворы яичного альбумина при старении мутнели в результате агрегации молекул альбумина, тогда как способность белка к кристаллизации при старении не изменялась [6].

Экстракция растворимых белков из тканей может происходить только после разрушения клеточных оболочек, так как последние непроницаемы для больших белковых молекул. Разрушения клеток можно достичь механическим путем, растирая их с песком или с кизельгуром; однако при этом наблюдается некоторая потеря белка за счет денатурации, вызываемой адсорбцией белка на силикате. По этой причине лучше разрушать клетки такими приборами, как мясорубка Латапи или гомогенизаторы. Структура клетки разрушается также при действии органических растворителей, например спирта, ацетона или глицерина. Если концентрация глицерина не превышает 85%, то в глицериновый экстракт переходит значительная часть растворимого белка. Этим способом можно экстрагировать гидролитические ферменты из поджелудочной железы и из других органов. Глицериновые экстракты при комнатной температуре относительно стабильны. Повидимому, рыхлая ассоциация белка с полярными гидроксильными группами глицерина уменьшает скорость его денатурации. Однако эти же полярные группы в молекуле глицерина обусловливают взаимное притяжение его молекул и высокую вязкость этого растворителя. Из глицериновых экстрактов очень трудно поэтому получить чистые препараты белков. В связи с этим глицерин в настоящее время редко применяется для разрушения клеточных оболочек. Вильштеттер и его сотрудники для разрушения клеток пользовались ацетоном. Этот метод основан на том, что многие белки при концентрации ацетона выше 80—90% денатурируются очень медленно. Для экстракции размельченный или пропущенный через мясорубку орган помещают в ацетон. Преимущество этой процедуры заключается в том, что ацетон не только разрушает клеточные оболочки, но одновременно экстрагирует из клеток и большинство липидов. Липиды можно затем удалить количественно при последующей обработке эфиром. Остаток после удаления липидов высушивается на листе фильтровальной бумаги и экстрагируется водой, разведенными растворами солей или буферов. Хотя большинство белков, в том числе много важных ферментов, можно получить из ацетоновых вытяжек в нативном состоянии, однако надо помнить, что некоторые лабильные белки при действии этого растворителя денатурируются.

Самым простым и наилучшим способом разрушения клеточных оболочек является дезинтеграция клеток попеременным замораживанием и оттаиванием. Ввиду того что во время замораживания образуются частички чистого льда, в клеточном содержимом увеличивается концентрация солей и клеточные оболочки разрываются в результате повышения осмотического давления. Механическое повреждение клеточных оболочек частичками льда может также приводить к разрушению клеток. Сходные осмотические эффекты можно получить, растирая клетки или ткани с сухими нейтральными солями.

Экстракты, приготовленные любым описанным выше методом, центрифугируют для удаления нерастворимых частичек. Соли, глицерин и другие вещества можно удалить диализом против дестиллированной воды. Некоторые белки нерастворимы в дестиллированной воде, и их можно выделить, воспользовавшись тем, что при диализе они выпадают в осадок. Так, например, если через раствор диализованного гемоглобина лошади пропускать кислород, то сразу же образуются кристаллы оксигемоглобина [7, 8]. Тенденция оксигемоглобина крысы к кристаллизации настолько велика, что кристаллы образуются при смешении эритроцитов крысы с 5—10-кратным объемом воды. Многие растительные белки и эвглобулины кровяной сыворотки также нерастворимы в дестиллированной воде и могут быть получены в виде осадков при продолжительном диализе.

Ранее для диализа употреблялись мембраны, приготовленные из кишок, пергамента или коллодия. Недостаток животных мембран заключается в их неоднородности; недочетом же пергаментной бумаги и коллодия является высокое содержание эфирносвязанных кислотных групп (серной и азотной кислот), которые вызывают денатурацию многих белков при адсорбции на этих мембранах. Наилучшим материалом для диализаторов может в настоящее время служить целлофан, приготовляемый из целлюлозы. Единственное отрицательное свойство целлофана — это малая величина его пор; в силу этой особенности скорость диффузии через целлофан очень мала. Увеличение продолжительности диализа нежелательно, так как оно усиливает опасность бактериальной инфекции. Чтобы избежать этой опасности, следует проводить диализ в рефрижераторе. Диаметр пор целлофана можно увеличить, обрабатывая мембраны водными растворами хлористого цинка. Выпуск в продажу подобных целлофановых мембран с повышенной проницаемостью значительно облегчил бы лабораторную работу. При проведении опытов небольшого масштаба самым подходящим материалом для получения мембран для диализаторов являются целлофановые трубки, из которых можно легко приготовить диализаторы самых различных размеров в виде мешочков. Продолжительность диализа можно сократить примерно на 25%, если перемешивать жидкость, омывающую мембрану диализатора. Дальнейшее увеличение скорости диффузии электролитов достигается применением электродиализа; при этом, однако, во избежание денатурации диализуемого белка, надо следить, чтобы вблизи поверхности мембран, отделяющих белковый раствор от анодной и катодной жидкостей, не создавалась резко кислая или резко щелочная реакция.

В то время как одни белки выпадают из растворов при диализе, другие осаждаются при добавлении нейтральных солей (метод высаливания). Обычная процедура высаливания состоит в предварительном доведении pH раствора до изоэлектрической точки осаждаемого белка, ибо в изоэлектрическом состоянии растворимость белков минимальна. Затем к перемешиваемому белковому раствору добавляют насыщенный раствор соли (или твердую соль) до тех пор, пока не появится легкая опалесценция. После этого раствор оставляют при комнатной температуре или в рефрижераторе. Если концентрация солей очень высока, часто можно работать при комнатной температуре, так как в этих условиях размножение бактерий резко заторможено. Для осаждения белков чаще всего употребляют сернокислый натрий или сернокислый аммоний. Так, например, если доведенные до изоэлектрической точки растворы сывороточного или яичного альбумина обработать сульфатом аммония [9] или сульфатом натрия [10], то происходит медленное образование кристаллов альбумина, которые оседают на дно сосуда. Образование кристаллов обусловлено медленным испарением раствора. При избытке соли образуется аморфный осадок белка. В таких случаях кристаллы белка можно получить путем диализа белкового раствора против насыщенного раствора сернокислого аммония.

Кристаллизацию можно также вызвать увеличением концентрации белка в растворе. Растворы многих стабильных веществ можно, как известно, концентрировать выпариванием на водяной бане или под уменьшенным давлением; однако ни тот, ни другой метод нельзя применить к белкам. Совершенно очевидно, что нагревание на водяной бане вызовет денатурацию белка. Впрочем, некоторые белки, например трипсин [1] или рибонуклеаза [11], устойчивы при определенном pH и определенной ионной силе к кратковременному нагреванию. Для концентрирования белковых растворов нельзя также использовать перегонку под пониженным давлением, так как в этих условиях происходит вспенивание. Небольшие объемы белковых растворов можно легко сконцентрировать в эксикаторе под слегка пониженным давлением над большими количествами связывающих воду веществ. Если нужно уменьшить большой объем белкового раствора, концентрирование проводят в целлофановом мешке, обдуваемом электрическим вентилятором (испарение через проницаемую мембрану). Раствор концентрируется по мере испарения воды с поверхности мешка [12]. Увеличения концентрации белка в растворе можно также достичь при помощи положительного или отрицательного давления во время диализа [13].

Для концентрирования больших объемов белковых растворов можно использовать также метод замораживания до твердого состояния с последующим очень медленным оттаиванием без перемешивания или встряхивания раствора. На поверхности раствора появляются при этом кристаллы льда, почти не содержащие белка; в нижней же части сосуда концентрируется основная масса белка. Концентрированный раствор белка сифонируют из нижней части сосуда. Эту процедуру можно повторять до тех пор, пока не получится высокая концентрация белка в растворе. Таким путем автором был получен в кристаллической форме гемоглобин человека [14]. Очень эффективным методом концентрирования белковых растворов является сушка из замороженного состояния [15]. Замороженный раствор белка выдерживается в высоком вакууме в присутствии связывающего воду вещества. С поверхности замороженного белкового раствора происходит возгонка льда. Белок получается в виде воздушносухого порошка (лиофильный метод, [16]). Этим способом было получено в нативном состоянии значительное число белков; некоторые белки, однако, как упоминалось выше, необратимо инактивируются или денатурируются при замораживании.

Одним из самых старых методов получения кристаллических белков является осторожное добавление этилового спирта или ацетона к холодному белковому раствору. Этим способом в конце прошлого столетия Гоппе-Зейлер и Гюфнер получили из крови многих животных кристаллический оксигемоглобин. В руках прежних авторов этот метод был, однако, чисто эмпирическим, и результаты его применения более или менее случайными. Значительного улучшения этого метода достигли Кон, Эдсалл, Онклей и их сотрудники [17]. Применение этилового спирта и других органических растворителей для осаждения белков основано на том, что органические растворители уменьшают диэлектрическую постоянную водных растворов белка. Противоположный эффект — увеличение диэлектрической постоянной — достигается добавлением глицина. Ввиду того что растворимость белков в большой степени зависит от диэлектрической постоянной растворителя, эти методы можно использовать для ступенчатого уменьшения растворимости белков и для их выделения в кристаллической форме. Само собой разумеется, что при подобной процедуре нужно контролировать и другие физикохимические факторы: температуру, pH, ионную силу. Варьируя эти факторы, можно достичь разделения некоторых белковых фракций. Результаты, полученные при помощи этих методов, более подробно описаны в гл. VIII.

Вполне понятно, что для очистки выделенного белка можно повторно применять описанные выше методы. Растворимые белки можно очистить путем перекристаллизации. Иногда для того, чтобы удалить различного рода примеси, выгодно воспользоваться несколькими методами очистки.