Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Методы выделения, очистки и определения белков
Критерий чистоты белков

В органической химии образование гомогенных кристаллов рассматривается как окончательное доказательство однородности соединения. Если кристаллы имеют воспроизводимую точку плавления, которая остается неизменной после перекристаллизации, то чистота соединения считается твердо установленной. Этот критерий чистоты неприложим к кристаллам белка, потому что белки разлагаются при нагревании. До недавнего времени способность некоторых белков к кристаллизации рассматривалась как указание на их гомогенность. Однако проверка поведения кристаллических белков в электрофоретическом аппарате показала, что это предположение было неверным. Оказалось, что яичный альбумин, который легко можно пере- кристаллизовать и который рассматривался в течение долгого времени как однородное вещество, представляет собой смесь, по крайней мере, двух компонентов, которые могут быть разделены электрофоретически [19]. Точно так же было показано, что кристаллический сывороточный альбумин [20] и кристаллический рицин из клещевины [21] представляют собой смесь двух и более компонентов. Эти данные не оставляют сомнения в том, что кристаллизация сама по себе еще не обеспечивает получения однородных чистых белков.

В качестве критерия чистоты соединения пользуются также растворимостью. Известно, что растворимость гомогенного вещества постоянна и не изменяется в присутствии избытка твердого вещества. Этот метод вряд ли пригоден для определения растворимости белков в чистой воде, так как растворимость белков в воде сильно зависит от следов электролитов и от концентрации водородных или гидроксильных ионов. Влияние этих веществ можно исключить, если в качестве растворителя использовать концентрированный раствор соли. При проверке растворимости кристаллического яичного альбумина или карбоксигемоглобина в растворе сернокислого аммония было найдено, что растворимость до некоторой степени зависит от количества твердой фазы [22]. На этом основании было сделано заключение, что молекулы этих белков можно рассматривать как системы обратимо диссоциирующих компонентов. Очень тщательные определения растворимости кристаллического химотрипсиногена [23] и рибонуклеазы [24] показали, что эти белки ведут себя как гомогенные соединения. В высшей степени важно, что эти гомогенные белки являются ферментами (см. гл. XII).

В последние годы для определения гомогенности белков пользуются электрофорезом при различных значениях pH (см. гл. V). При помощи электрофореза было показано, что кристаллический яичный альбумин, бычий сывороточный глобулин, ß-лактоглобулин и все остальные исследованные по этому методу белковые препараты представляют собой смесь нескольких белков [25]. Вполне возможно, что совершенно однородных белковых молекул вообще не существует и так называемые «чистые» белки представляют собой в действительности смесь очень сходных белковых молекул. До сих пор, однако, остается невыясненным, является ли гетерогенность белков, обнаруживаемая при электрофорезе или при исследовании растворимости, следствием изменений, происходящих при выделении белков из их естественной среды, или же эта гетерогенность присуща и нативным белкам клеток и жидкостей организма.

Действительно, было обнаружено, что при действии Вас. subtilis на яичный альбумин форма кристаллов, электрофоретические свойства и молекулярный вес этого белка значительно изменяются [26]. Было установлено, что при этом от яичного альбумина отщепляется небольшое количество азотистых веществ, в результате чего получается новый, родственный исходному белок, так называемый плакальбумин. Аналогичные изменения в свойствах альбумина наблюдаются и при старении его раствора [27].

Вполне допустимо предположение, что сами методы выделения белков обусловливают сходные изменения в физико-химических свойствах выделяемых белков. Естественно, что ответ на этот вопрос имеет большое значение и что интерпретация результатов химических и физико-химических исследований белков в значительной степени зависит от разрешения этого вопроса.

Если о чистоте и однородности растворимых белков мы можем до некоторой степени судить по образованию кристаллов и по определению их физико-химических свойств, то для нерастворимых белков, таких, как кератин или коллаген, мы не имеем и этих возможностей. Остается поэтому совершенно неизвестным — однородны ли эти белки или же они представляют собой смеси различных белков.

¹ В 1947 г. В. Н. Ореховичем, А. А. Тустановским и К. Д. Орехович был выделен из кожи различных животных легко кристаллизующийся белок, названный авторами проколлагеном (ДАН СССР, 57, 5, 1947). В кислых экстрактах из кожи или сухожилий этот белок присутствует наряду с коллагеном, и ряд авторов (Нажотт, Форе-Фремье и др.) рассматривали его как особую разновидность коллагена, названную ими растворимым коллагеном. В дальнейших исследованиях В. Н. Ореховича, А. А. Тустановского, К. И. Страчицкого, К. Д. Орехович, Н. А. Брнскер и Н. Е. Плотниковой (В. Н. Орехович, Проколлагены, их химический состав, свойства и биологическая роль, изд. АМН СССР, Москва, 1952) было, однако, установлено, что по своему аминокислотному составу и ряду физико-химических свойств проколлаген значительно отличается от коллагена. Этими исследователями была, таким образом, показана ошибочность взглядов Нажотта и других авторов и одновременно выяснена причина многих имеющихся в литературе разногласий по вопросу о свойствах коллагена.

Эти разногласия в большинстве случаев зависят от наличия примеси проколлагена в изучаемых препаратах коллагена. Более детальные данные о составе и свойствах проколлагена см. примечание на стр. 210. — Прим. ред.