БІОХІМІЯ - Лабораторний практикум - НАУ 2015

МОДУЛЬ IV

МЕТАБОЛІЗМ ОСНОВНИХ КЛАСІВ БІОМОЛЕКУЛ

Лабораторна робота 11

МОДЕЛЮВАННЯ РЕАКЦІЙ ГЛІКОЛІЗУ В ЕКСПЕРИМЕНТІ

Мета роботи: підтвердити експериментально перетворення глюкози гліколітичним шляхом.

Основні теоретичні відомості

Гліколіз — це метаболічний шлях перетворення глюкози на піруват (в аеробних умовах) або на лактат (в анаеробних умовах). Анаеробний гліколіз — основний шлях енергетичного метаболізму за відсутності кисню. Сумарний енергетичний ефект гліколізу — утворення двох молекул АТФ у розрахунку на одну молекулу глюкози.

Ферменти гліколізу містяться в цитоплазмі. Гліколіз складається з двох стадій. У результаті першої стадії — фосфорилювань — з глюкози, що є гексозою, утворюються дві фосфотріози. Одна з них — гліцеральдегід-3-фосфат — є субстратом другої стадії гліколізу, яка називається стадією гліколітичної оксидоредукції. Гліцеральдегід-3-фосфат окиснюється, відновні еквіваленти від нього та від неорганічного фосфату акцептуються коферментом НАД⁺, який переносить два атоми водню на піруват, що перетворюється в лактат.

Перебіг процесу гліколізу можна експериментально підтвердити утворенням молочної кислоти і зменшенням вмісту неорганічного фосфату в інкубаційній суміші за наявності в ній гліколітичних ферментів та субстрату — глюкози.

Обладнання: пробірки, піпетки, фарфорова ступка з пестиком, скляний пісок, вата, лійка, рН-метр, фільтри, термостат, ваги, крапельниця.

11.1. Вивчення процесу гліколізу в суспензії дріжджів

Матеріали та реактиви: пивні дріжджі (5 г) розтирають у фарфоровій ступці з 2—3 мл дистильованої води та невеликою кількістю скляного піску, додають 8—10 мл води та фільтрують крізь вату; фосфатний буфер 1/15 М, рН = 7,4 (9,46 г/л Na₂НРО₄; 10,40 г/л NaH₂PO₄ · 2H₂O, доводять рН до 7,4, змішуючи розчини), 1 %-й розчин глюкози, вазелінове масло, 2 %-й розчин трихлороцтової кислоти (ТХО), 1 %-й розчин FeCl₃, 1 %-й розчин фенолу, розчин молібдату амонію (0,5 г чистого молібдату амонію розчиняють у
100 мл води, фільтрують, змішують із 100 мл 10 М розчину сірчаної кислоти), 0,1 %-й розчин аскорбінової кислоти.

Порядок виконання роботи

Дві пробірки заповнюють реактивами за табл.11.1.

Таблиця 11.1

Вміст контрольної та дослідної пробірок

В одну з пробірок (контрольна проба) відразу вносять 2 мл розчину трихлороцтової кислоти для інактивації ферментів і перемішують.

Вазелінове масло нашаровують в обидві пробірки для створення анаеробних умов. Інкубують у термостаті за температури 37 °С. Через 1 год. у пробірку з досліджуваною пробою додають 2 мл розчину трихлороцтової кислоти і перемішують. Уміст обох пробірок фільтрують, звільняючи від білка.

Після інкубації визначають утворену молочну кислоту, яка є кінцевим продуктом гліколізу, і зменшення вмісту неорганічного фосфору (використаного в реакціях фосфорилування).

Визначення молочної кислоти в інкубаційному середовищі

Із кожної пробірки беруть по 1,0 мл розчину, додають по
5 крапель 1 %-го FeCl₃ і по 1,0 мл 1 %-го розчину фенолу. Унаслідок взаємодії феноляту заліза фіолетового кольору з молочною кислотою утворюється лактат заліза жовто-зеленого кольору.

Спостерігають появу жовто-зеленого забарвлення.

Визначення неорганічного фосфору в інкубаційному середовищі

Із кожної пробірки беруть по 1,0 мл рідини, додають по 1,0 мл молібдату амонію і спостерігають зміну кольору. Взаємодія неорганічного фосфору з молібдатом амонію зумовлює утворення в кислому середовищі амонійної солі фосфорномолібденової кислоти — (NH₄)₃РО₄ · 12МоО₃ · 6Н₂О характерного жовтого кольору.

Додають по 1 мл розчину аскорбінової кислоти. Уміст пробірок добре перемішують. Молібдат амонію внаслідок відновлення аскорбіновою кислотою перетворюється на фосфорномолібденову синь, інтенсивність забарвлення якої пропорційна вмісту фосфору в досліджуваному матеріалі.

Через 10 хв проби фотометрують із червоним світлофільтром.

Оброблення експериментальних даних

Напишіть послідовно всі реакції анаеробного гліколізу, виділіть стадії, покажіть реакції фосфорилування, субстратного фосфорилування, окисно-відновні реакції. Покажіть реакцію, у якій використовується неорганічний фосфат; утворюється лактат.

Результати експерименту занесіть до табл.11.2.

Таблиця 11.2

Визначення молочної кислоти (утворюється в ході гліколізу) та неорганічного фосфату (використовується в ході гліколізу)

Контрольні запитання та завдання

1. Напишіть реакцію утворення феноляту заліза, лактату заліза.

2. Поясніть принцип визначення неорганічного фосфату.

3. Поясніть необхідність розтирання дріжджів із скляним піском.

4. Поясніть відмінність між аеробним та анаеробним гліколізом. Якою реакцією вони розрізняються?

5. Які кінцеві продукти та енергетика повного аеробного окиснення глюкози? Наведіть послідовність процесів, які його складають.

Література: [1; 4—7].