БІОХІМІЯ - Лабораторний практикум - НАУ 2015
МОДУЛЬ I
БІОХІМІЧНІ КОМПОНЕНТИ КЛІТИНИ
Лабораторна робота 5
ВИЯВЛЕННЯ ВІТАМІНІВ У МОДЕЛЬНИХ РОЗЧИНАХ
Мета роботи: опанувати методи виявлення водо- та жиророзчинних вітамінів.
Основні теоретичні відомості
Вітаміни — низькомолекулярні органічні речовини. Вони мають надходити в організм у невеликих кількостях, але відіграють значну роль у метаболізмі. Водорозчинні вітаміни не нагромаджуються в організмі, тоді як жиророзчинні можуть депонуватись, як правило, в печінці.
Водорозчинні вітаміни утворюють коферменти, що працюють разом з ферментами і є обов’язковими для перебігу певних біохімічних реакцій. Так, наприклад вітамін В1 (тіамін) утворює кофермент тіаміндифосфат (тіамінпірофосфат), який бере участь у реакціях окисного декарбоксилювання α-кетокислот. Вітаміни В2 (рибофлавін) та В5 або РР (нікотинамід) утворюють коферменти дегідрогеназ: ФАД (флавінаденіндинуклеотидфосфат) і ФМН (флавінмононуклеотид) побудовані на основі рибофлавіну (в основі його структури лежить ізоалоксазинове кільце), НАД(Ф) (нікотинамідаденіндинуклеотид(фосфат)) — на основі нікотинаміду (в основі його структури — піридинове кільце). Вітамін В6 (піридоксаль і піридоксамін) є основою коферментів ПАЛФ (піридоксальфосфату) та ПАМФ (піридоксамінфосфату), які беруть участь у трансферазних реакціях. В основі його структури також лежить піридин. Вітамін С існує в окисненій та відновленій формах (аскорбінова кислота та дегідроаскорбінова кислота), бере участь в окисно-відновних реакціях, він може бути синтезованим з
L-сорбози, що є кетогексозою. Усі водорозчинні вітаміни іноді об’єднують під назвою вітамінів групи В.
Жиророзчинні вітаміни не утворюють коферментів. Їх функції дуже різноманітні. Вони впливають на ріст і розмноження організмів, диференціювання тканин, побудову скелета, забезпечують цілісність біологічних мембран і можливість поділу клітин, захищають організм від крововиливів, беруть участь у сприйманні зорової інформації і т. ін. До жиророзчинних належать вітаміни А, D, E, K, F (комплекс поліненасичених вищих жирних кислот).
Обладнання: штатив із пробірками, крапельниці, піпетки, шпатель, термостат, водяна баня.
5.1. Якісні реакції на вітамін Р (рутин, вітамін проникності, цитрин)
Матеріали та реактиви: рутин (порошок і насичений водний розчин), 1 %-й розчин хлориду заліза (III), концентрована сірчана кислота, 0,5 %-й розчин соляної кислоти, 10 %-й розчин гідроксиду натрію, реактив Фелінга (див. лабораторну роботу 2).
Порядок виконання роботи
Реакція рутину з хлоридом заліза(III)
До 2 мл насиченого водного розчину рутину додають кілька крапель розчину FeCl3. Хлорид заліза(III) утворює з рутином комплексні сполуки, забарвлені в смарагдово-зелений колір.
Спостерігають появу зеленого забарвлення.
Реакція рутину з концентрованою сірчаною кислотою
До 2 мл насиченого водного розчину рутину обережно по стінці пробірки доливають 1 мл концентрованої сірчаної кислоти. Концентрована сірчана кислота утворює з флавонами та флавонолами, до яких належить вітамін Р, флавілієві солі, розчини яких мають яскраво-жовте забарвлення.
На межі поділу двох рідин виникає кільце жовтого кольору.
Реакція рутину з реактивом Фелінга
До 0,5 г рутину доливають 5 мл розчину соляної кислоти, кип’ятять протягом 1 хв, потім фільтрують. Під час кислотного гідролізу рутину відщеплюється молекула рутинози. Потім рутиноза розкладається на глюкозу та рамнозу, які мають відновні властивості, тому можуть бути визначеними реакціями Толленса, Троммера, Фелінга. До 5 мл фільтрату додають 3 мл розчину гідроксиду натрію та 3 мл свіжовиготовленого реактиву Фелінга і знову нагрівають до кипіння.
Спостерігають утворення осаду геміоксиду міді червоного кольору.
5.2. Якісні реакції на вітамін С
Матеріали та реактиви: розчин 2,6-дихлорфеноліндофенолу (0,1 %-й), 10 %-й розчин соляної кислоти, 0,1 %-й розчин йоду в калію йодиді, 0,01 %-й розчин метиленового синього, 10 %-й розчин Na2CО3, 1 %-й розчин K3[Fe(CN)6], 1 %-й розчин FeCl3, 0,1 %-й розчин аскорбінової кислоти, витяжка із шипшини, дистильована вода.
Порядок виконання роботи
Відновлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу аскорбіновою кислотою
У три пробірки вносять по 0,5 мл розчину 2,6-дихлорфенол-індофенолу, по одній-дві краплі розчину НС1 і по краплях розчин аскорбінової кислоти або витяжку з шипшини (в контрольну пробірку додають 0,5 мл дистильованої води). Аскорбінова кислота здатна відновлювати 2,6-дихлорфенол-індофенол, який переходить при цьому в безбарвну лейкосполуку.
Розчин 2,6-дихлорфеноліндофенолу знебарвлюється.
Відновлення метиленового синього аскорбіновою кислотою
У три пробірки додають по одній краплі розчину метиленового синього і розчину карбонату натрію. В першу пробірку додають 5 крапель розчину аскорбінової кислоти, у другу — витяжки з шипшини, у третю — стільки ж дистильованої води. Пробірки одночасно нагрівають за температури 37—40 °С. Аскорбінова кислота здатна відновлювати метиленовий синій, який переходить у безбарвну лейкосполуку.
У пробірках з аскорбіновою кислотою та витяжкою із шипшини рідина знебарвлюється.
Відновлення гексаціано(ІІ) ферату калію аскорбіновою кислотою
У три пробірки додають по одній краплі розчинів гексаціано(ІІI) ферату калію і хлориду феруму. В одну з пробірок до утвореної зелено-бурої рідини додають 5—10 крапель розчину аскорбінової кислоти, у другу — 5—10 крапель витяжки з шипшини, у третю (контрольну) — 5—10 крапель дистильованої води. Аскорбінова кислота відновлює гексаціано(ІІІ)ферат калію до гексаціано(ІІ) ферату калію, який, реагуючи з хлоридом феруму, утворює берлінську лазур — сполуку синього кольору.
Рідина в першій і другій пробірках забарвлюється в зелено-синій колір і випадає синій осад берлінської лазурі. За обережного нашаровування дистильованої води осад на дні пробірки стає виразнішим. У контрольній пробірці зелено-бура рідина забарвлення не змінює.
Відновлення молекулярного йоду аскорбіновою кислотою
У три пробірки додають по 10 крапель дистильованої води і по 1—2 краплі розчину йоду в йодиді калію. У першу пробірку додають 10 крапель аскорбінової кислоти, у другу — 10 крапель витяжки з шипшини, у третю (контрольну) — 10 крапель дистильованої води. Аскорбінова кислота здатна відновлювати молекулярний йод, який переходить при цьому у безбарвну йодидну кислоту.
Спостерігають знебарвлення розчину йоду в пробірках з аскорбіновою кислотою та з витяжкою з шипшини.
5.3. Реакція на тіамін (вітамін В1) з діазореактивом
Матеріали та реактиви: розчин сульфанілової кислоти (1 %-й), 5 %-й розчин нітрату натрію, 10 %-й розчин бікарбонату натрію, тіамін (порошок або його 5 %-й розчин).
Порядок виконання роботи
У пробірку вливають 1 мл розчину сульфанілової кислоти та
1 мл розчину нітрату натрію (утворюється діазореактив). Потім у пробірку вносять невелику кількість (на кінчику шпателя) порошку або 0,5 мл розчину тіаміну і по стінці пробірки обережно додають
1 мл розчину Na2CО3. Вітамін В1 у лужному середовищі з діазореактивом утворює складну комплексну сполуку жовтогарячого або червоного кольору.
Спостерігають появу забарвленого кільця на межі двох рідин.
5.4. Реакції відновлення рибофлавіну (вітаміну В2)
Матеріали та реактиви: концентрована соляна кислота, металевий цинк, 0,025 %-й розчин вітаміну В2 (суспензія рибофлавіну у воді).
Порядок виконання роботи
У пробірку вливають 1 мл розчину вітаміну В2, 0,5 мл концентрованої соляної кислоти і кидають грудочку металевого цинку. Під час змішування металевого цинку з концентрованою соляною кислотою утворюється водень, який відновлює жовтий рибофлавін спочатку на родофлавін (проміжна сполука) червоного кольору, а потім на безбарвний лейкофлавін.
Рідина в пробірці поступово забарвлюється в рожевий колір, а потім знебарвлюється. Під час збовтування знебарвлений розчин лейкофлавіну знову окиснюється киснем повітря на рибофлавін.
Спостерігають зміну забарвлення.
5.5. Реакція на вітамін РР (антипелагричний, В5) з ацетатом міді
Матеріали та реактиви: порошок вітаміну РР, 10 %-й розчин оцтової кислоти, 5 %-й розчин ацетату міді.
Порядок виконання роботи
У пробірку вносять 5—10 мг вітаміну РР і розчиняють під час нагрівання в 1—2 мл розчину оцтової кислоти. До нагрітого до кипіння розчину додають такий же об’єм розчину ацетату міді. У процесі нагрівання вітаміну РР з розчином ацетату міді утворюється погано розчинний осад мідної солі вітаміну РР синього кольору.
Рідина стає каламутною і набуває блакитного кольору. Через деякий час відмічають появу синього осаду.
5.6. Реакція з хлоридом заліза на піридоксин (вітамін В6)
Матеріали та реактиви: водний розчин (1 %-й) вітаміну В6,
1 %-й розчин FeCl3.
Порядок виконання роботи
У пробірці перемішують 1 мл водного розчину піридоксину та дві краплі розчину хлориду заліза. Під час взаємодії піридоксину з розчином хлориду заліза рідина забарвлюється в червоний колір завдяки утворенню комплексної солі типу феноляту заліза.
Спостерігають забарвлення рідини.
5.7. Якісні реакції на жиророзчинні вітаміни
Якісні реакції на вітамін А
Матеріали та реактиви: хлороформний розчин трихлороцтової сурми (33 %-й); хлороформ; 0,05 %-й масляний розчин вітаміну А в хлороформі або розчин риб’ячого жиру в хлороформі у співвідношенні 1:5; концентрована сірчана кислота, насичена сульфатом заліза(II); льодяна оцтова кислота.
Порядок виконання роботи
Реакція з трихлороцтовою сурмою
У суху пробірку до однієї-двох крапель розчину вітаміну А в хлороформі або розчину риб’ячого жиру в хлороформі додають чотири-п’ять крапель розчину трихлороцтової сурми в хлороформі й перемішують. Хлороформний розчин вітаміну А або риб’ячого жиру з трихлороцтовою сурмою забарвлюється в специфічний синій колір.
Спостерігають забарвлення рідини.
Реакція Друммонда
У пробірку до двох-трьох крапель розчину вітаміну А додають дві-три краплі концентрованої сірчаної кислоти. Вітамін А з концентрованою сірчаною кислотою у бензольному розчині утворює комплекс синього кольору.
Уміст пробірки забарвлюється в синій колір, який через деякий час змінюється на фіолетовий і бурий.
Спостерігають зміну забарвлення.
Реакція із сульфатом заліза(II)
У пробірку до двох-трьох крапель розчину риб’ячого жиру в хлороформі або масляного розчину вітаміну А в хлороформі доливають п’ять-десять крапель концентрованої сірчаної кислоти, насиченої сульфатом заліза(II), і одну-дві краплі льодяної оцтової кислоти. Вітамін А із сульфатом заліза(II) у кислому середовищі у хлороформному розчині утворює сполуку червоно-рожевого кольору.
Спостерігають появу блакитного забарвлення, яке поступово перетворюється на червоно-рожеве.
Каротини у цій реакції мають зелене забарвлення.
Якісні реакції на вітамін D
Матеріали та реактиви: насичений розчин SbCl5, хлороформний розчин вітаміну D, хлороформ, аніліновий реактив — анілін із концентрованою НС1 (15:1), розчин брому в хлороформі (1:60).
Порядок виконання роботи
Реакція з хлоридом сурми(V)
У суху пробірку до 2 мл розчину вітаміну D у хлороформі доливають 0,2 мл насиченого розчину SbCl5. Вітамін D у хлороформному розчині з насиченим розчином хлориду сурми(V) утворює жовте забарвлення.
Спостерігають появу забарвлення.
Реакція з аніліном
У суху пробірку вносять одну-дві краплі риб’ячого жиру або розчину вітаміну D у хлороформі й додають одну краплю анілінового реактиву. Після перемішування утворюється емульсія жовтого кольору. Під час нагрівання емульсії із сумішшю аніліну та концентрованої соляної кислоти розчин забарвлюється в червоний колір.
Через 1—2 хв емульсія розділяється на два шари. Нижній шар забарвлений в інтенсивний червоний колір.
Реакція з бромом
У пробірку з двома-чотирма краплями розчину вітаміну D в хлороформі або риб’ячого жиру додають чотири-п’ять крапель розчину брому в хлороформі.
Спостерігають поступове забарвлення суміші в пробірці в зелено-блакитний колір.
Якісні реакції на вітамін К
Матеріали та реактиви: розчин діетилмалонового ефіру (1 %-й), 1 %-й розчин КОН, спиртовий розчин вітаміну К, 5 %-й розчин діетилдитіокарбамату, 4 %-й спиртовий розчин NaOH, розчин аніліну, 0,05 %-й спиртовий розчин вікасолу.
Порядок виконання роботи
Реакція з діетилмалоновим ефіром
У пробірку до 2 мл спиртового розчину вітаміну К додають 0,5 мл розчину діетилмалонового ефіру та 0,1 мл розчину КОН. Спиртовий розчин вітаміну К у лужному середовищі з діетилмалоновим ефіром має червоно-фіолетове забарвлення.
Спостерігають появу червоно-фіолетового забарвлення.
Реакція з діетилдитіокарбаматом
У пробірку до 2 мл спиртового розчину вітаміну К додають 2 мл розчину діетилдитіокарбамату та 0,5 мл розчину NaOH в етанолі. Спиртовий розчин вітаміну К в лужному середовищі з діетилдитіокарбаматом утворює сполуку, забарвлену в блакитний колір.
Спостерігають появу забарвлення.
Реакція з аніліном
У пробірку з 1 мл спиртового розчину вікасолу додають дві краплі аніліну. За наявності аніліну спиртовий розчин вітаміну К забарвлюється в червоний колір, що зумовлено утворенням 1-метил-2-феніламінонафтохінону.
Перемішують і спостерігають появу забарвлення.
Якісні реакції на вітамін Е
Матеріали та реактиви: спиртовий розчин (0,1 %-й) α-токоферолу, концентрована азотна кислота, 1 %-й розчин хлорного заліза(III).
Порядок виконання роботи
Реакція з азотною кислотою
У суху пробірку вносять п’ять крапель спиртового розчину вітаміну Е, додають 1 мл концентрованої HNО3, інтенсивно перемішують. Взаємодія α-токоферолу з концентрованою азотною кислотою зумовлює забарвлення реакційної суміші в червоний колір. Це спричинено тим, що продукт окиснення α-токоферолу має хіноїдну структуру.
Спостерігають поступову появу червоного забарвлення.
Реакція з хлорним залізом
У суху пробірку вносять 0,5 мл спиртового розчину
α-токоферолу, потім 0,5 мл розчину FeCl3 й інтенсивно перемішують. Під час взаємодії з хлорним залізом(III) α-токоферол окиснюється до α-токоферилхінону — сполуки червоного кольору:
Спостерігають появу забарвлення.
Оброблення експериментальних даних
Побудуйте таблицю, у якій вкажіть: відомі вам водорозчинні вітаміни; коферменти, що їм відповідають; реакції, які перебігають за участю коферментів; реакції, якими можна виявити вітаміни; харчові джерела вітамінів та добову потребу в них.
Побудуйте таблицю, у якій вкажіть жиророзчинні вітаміни, їх біологічну роль, харчові джерела вітамінів та добову потребу в них.
Контрольні запитання та завдання
1. Яка біологічна роль водорозчинних вітамінів? Напишіть формули вітамінів В1, В2, В5, В6, С.
2. Напишіть реакцію фенолу та вітаміну В6 з FeCl3. Покажіть утворення трьох ковалентних і трьох координаційних зв’язків. Покажіть фенольні гідроксили в молекулі рутину.
3. Яка властивість аскорбінової кислоти лежить в основі її виявлення?
4. Напишіть ізоалоксазинове кільце, що становить основу рибофлавіну, в окисненій та відновленій формах. Напишіть коферменти вітамінів В5 та В2 в окисненій та відновленій формах.
5. Які жиророзчинні вітаміни ви знаєте? Яка роль вітамінів А, D, Е, К, F у метаболізмі?
6. Яка речовина є попередником при синтезі вітаміну D в організмі людини? Який гормон синтезується з вітаміну D?
7. Покажіть у структурі вітаміну Е частину, що є хіноном.
8. Поясніть принципи реакцій виявлення жиророзчинних вітамінів. Чи можуть вони використовуватися для кількісного визначення?