БІОХІМІЯ - Лабораторний практикум - НАУ 2015

МОДУЛЬ II

ФЕРМЕНТИ ТА МЕТАБОЛІЧНІ ШЛЯХИ.

ЕНЕРГЕТИЧНИЙ МЕТАБОЛІЗМ

Лабораторна робота 6

ВИЗНАЧЕННЯ НАЯВНОСТІ ФЕРМЕНТУ В БІОЛОГІЧНІЙ РІДИНІ. ВИЗНАЧЕННЯ СПЕЦИФІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ФЕРМЕНТІВ ЯК БІОЛОГІЧНИХ КАТАЛІЗАТОРІВ

Мета роботи: засвоїти основні принципи виявлення ферментів, уміти їх застосовувати для доведення наявності ферменту в біологічній рідині. Уміти доводити в експерименті специфічні властивості ферментів.

Основні теоретичні відомості

Ферменти — біологічні каталізатори білкової природи, які мають спільні риси з неорганічними каталізаторами, а також специфічні властивості. Наявність ферменту в біологічній рідині можна довести за його активністю. Ферменти прискорюють хімічні реакції, у яких субстрат тим чи іншим чином перетворюється на продукт реакції. Тому якщо фермент виявляє активність, субстрату стає менше, а продукту реакції — більше. За зменшенням кількості субстрату і збільшенням кількості продукту реакції можна оцінити активність будь-якого ферменту.

До специфічних властивостей ферментів належить залежність їх дії від температури, рН середовища, від наявності модуляторів (або ефекторів), які можуть або посилювати активність ферменту (активатори), або зменшувати її (інгібітори). Активність ферменту залежить також від концентрації субстрату. Крім того, ферменти є високоспецифічними відносно субстрату, перетворення якого каталізується.

Зі зниженням температури активність ферментів знижується, досягаючи мінімального значення за температури 0 °С. Під час підвищення температури на кожні 10 градусів активність ферменту зростає в 2—4 рази, доки не досягне максимальної. Температура, за якої спостерігається максимальна швидкість ферментативної реакції, називається оптимальною. Під час подальшого нагрівання, для більшості ферментів до 50—70 °С, фермент втрачає властивості біологічного каталізатора через теплову денатурацію білкової молекули.

Кожен фермент має своє значення рН середовища, за якого його активність максимальна — оптимальне рН. Для більшості ферментів людського організму це значення становить 6,8 — 7,4. Крива залежності активності ферменту від рН середовища на відміну від температурної залежності симетрична.

Активатори ферментів — це, як правило, іони металів, але іноді й аніони (для α-амілази — аніони хлору). Переважний механізм дії — зв’язування з алостеричним центром ферменту, унаслідок чого змінюються конформація молекули ферменту і просторова відповідність молекул ферменту та субстрату. За таким самим механізмом можуть діяти і специфічні неконкурентні інгібітори ферментів. Конкурентні інгібітори конкурують з істинним субстратом за місця зв’язування в активному центрі ферменту. Підвищенням концентрації істинного субстрату можна позбавитись впливу конкурентного інгібітору, бо він витісняється з активного центру. Інгібування може бути неспецифічним, його зумовлює будь-який чинник, що руйнує структуру ферменту, денатурує його.

Із підвищенням концентрації субстрату швидкість ферментативної реакції зростає. Але з досягненням певної концентрації субстрату — концентрації насичення — всі місця зв’язування субстрату в активному центрі ферменту виявляються зайнятими, і подальше підвищення концентрації субстрату не пришвидшує перебіг реакції.

Обладнання: штатив із пробірками, піпетки, крапельниці, фарфорова ступка з товкачиком, лійки, термостат, водяна баня, газовий пальник.

6.1. Дія сахарази

Матеріали та реактиви: препарат сахарази (5 г пивних дріжджів розтирають у фарфоровій ступці з 2—3 мл дистильованої води та невеликою кількістю скляного піску, додають 8—10 мл води та фільтрують крізь вату), 2 %-й розчин сахарози, реактив Фелінга (див. лабораторну роботу 2).

Порядок виконання роботи

У пробірку наливають 1 мл препарату ферменту, додають 3 мл розчину сахарози, добре перемішують і ставлять у термостат за температури 38 °С. Сахараза каталізує гідроліз сахарози до глюкози та фруктози:

Глюкозу, яка утворюється, визначають реакцією Фелінга. Для цього через 15 хв у пробірку вносять 2 мл реактиву Фелінга, перемішують і нагрівають до кипіння. Утворюється червоний осад геміоксиду міді. Сахароза не містить вільної альдегідної групи й тому не має відновних властивостей.

Результати дослідження заносять до табл.6.1.

Таблиця 6.1

Визначення активності сахарази

6.2. Дія амілази

Матеріали та реактиви: розчин крохмалю (0,2 %-й), 0,1 %-й розчин йоду в 0,2 %-у розчині йодиду калію, розчин слини, що містить фермент.

Приготування розчину слини — рот два-три рази ополіскують водою, далі відмірюють циліндром 50 мл дистильованої води й полощуть нею рот кілька разів протягом 3—5 хв. Зібрану рідину фільтрують крізь вату. Фільтрат використовують як джерело ферменту.

Порядок виконання роботи

У дві пробірки наливають по 5 мл крохмального клейстеру, в одну з них додають 0,5 мл розчину слини, яка містить амілазу, добре перемішують і залишають стояти за кімнатної температури. Амілаза є ферментом, який каталізує гідроліз α-1-4-глікозидного зв’язку крохмалю та глікогену до проміжних продуктів — декстринів. Крохмаль (за рахунок амілози) утворює з йодом сполуки синього кольору, декстрини — фіолетового, червоно-бурого, жовтого. Кінцевим продуктом гідролізу крохмалю є глюкоза.

Через 15 хв у обидві пробірки додають по п’ять крапель розчину йоду. У пробірці з амілазою слини розчин через 1 год знебарвлюється, а в пробірці без амілази колір розчину не змінюється, тобто залишається синьо-фіолетовим.

6.3. Вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази

Матеріали та реактиви: розчин слини, 0,5 %-й розчин крохмалю, 0,1 %-й розчин йоду в 0,2 %-у розчині йодиду калію,
1 %-й розчин NaCl, 1 %-й розчин CuSО₄.

Порядок виконання роботи

Готують три пробірки. В першу наливають 2,5 мл води, у другу — 2 мл води та 0,5 мл розчину NaCl, у третю — 2 мл води та 0,5 мл розчину CuSO₄. У всі пробірки додають по 2,5 мл розчину слини, перемішують, вносять по 2,5 мл розчину крохмалю, потім знову перемішують і ставлять у термостат за температури 38 °С. Активатором амілази є NaC1, а інгібітором — CuSO₄. Вплив цих речовин на активність амілази визначають за ступенем гідролізу крохмалю під впливом ферменту за наявності NaCl і CuSO₄.

Через 5 хв додають по п’ять крапель розчину йоду. Рідина в першій пробірці забарвлюється у фіолетовий або червоний колір, у другій — у червоний або жовтий, у третій — у синій.

6.4. Дослідження впливу високих температур на активність α—амілази слини

Матеріали та реактиви: розчин крохмалю (0,2 %-й), 0,1 %-й розчин йоду в 0,2 %-у розчині йодиду калію, реактив Фелінга (див. лабораторну роботу 2), розчин слини, що містить фермент.

Порядок виконання роботи

Вплив температури на активність амілази слини проявляється у зміні інтенсивності розщеплення крохмалю цим ферментом за різних температурних умов зберігання ферменту. У дві пробірки додають по 1 мл розведеної у 2 рази слини, в інші дві — по 1 мл розведеної так само слини після попереднього кип’ятіння (протягом 2 хв). В усі чотири пробірки додають по 2 мл 0,2 %-го розчину крохмалю і ставлять у термостат за t° = 37 °C на 15 хв.

Ступінь розщеплення крохмалю визначають за допомогою реакції з йодом (за зменшенням кількості субстрату) або реакції Фелінга (за збільшенням кількості продукту реакції). Для цього після інкубації проводять реакцію з йодом (0,1 %-м розчином йоду в 0,2 %-у розчині йодиду калію), додаючи по 1—2 краплі у дві пробірки (з некип’яченою слиною і зі слиною після кип’ятіння), та з реактивом Фелінга (додають по 2 мл реактиву Фелінга так само в дві пробірки, з некип’яченою слиною і зі слиною після кип’ятіння, перемішують і нагрівають до кипіння). Спостерігають забарвлення при реакції з йодом і утворення осаду в реакції Фелінга.

Результати дослідження заносять до табл.6.2:

Таблиця 6.2

Визначення активності α-амілази слини

6.5. Вплив рН на активність амілази

Матеріали та реактиви: розчин слини, 1 %-й розчин крохмалю, 0,1 %-й розчин йоду в 0,2 %-у розчині йодиду калію, фосфатний буфер з різними значеннями рН, загальний об’єм буферного розчину — 100 мл (табл. 6.3).

Таблиця 6.3

Склад фосфатного буферу, мл

Порядок виконання роботи

Вплив рН на активність амілази визначають за зміною інтенсивності забарвлення розчину крохмалю з йодом.

У сім пробірок наливають по 2 мл буферного розчину з різними значеннями рН. Потім доливають по 5 мл розчину крохмалю та по 1 мл розчину слини. Вміст пробірок перемішують і ставлять у термостат на 10 хв за температури 38 °С. Після інкубації в термостаті в усі пробірки додають по п’ять крапель розчину йоду, перемішують, спостерігають інтенсивність забарвлення. Для наочності в кожну пробірку можна долити декілька мілілітрів дистильованої води й розмішати.

Оптимум рН для амілази слини становить 6,8; у кислому та лужному середовищах активність амілази знижується.

Оброблення експериментальних даних

Побудуйте схему взаємодії ферменту і субстрату в ході реакції. У який спосіб можна виявити наявність ферменту у біологічній рідині? Поясніть на прикладі сахарази, амілази.

Яким чином можна експериментально довести наявність у ферментів специфічних властивостей? Побудуйте таблицю, у якій наведіть експериментальні підтвердження специфічних властивостей амілази.

Контрольні запитання та завдання

1. Назвіть основні способи виявлення ферментів у біологічних рідинах, проілюструйте відповідь способами визначення активності амілази слини.

2. Назвіть спільні властивості ферментів і неорганічних каталізаторів, специфічні властивості ферментів.

3. Назвіть функціонально активні ділянки молекули ферменту.

4. Які ферменти називають алостеричними?

5. Побудуйте графіки залежності активності амілази слини від температури, від рН середовища.

6. Як швидкість ферментативної реакції залежить від концентрації ферменту, від концентрації субстрату? Побудуйте відповідні графіки.

7. Яка константа характеризує спорідненість ферменту та субстрату? Чому вона чисельно дорівнює?

8. Чому активатори підвищують ферментативну активність?

9. Як класифікують інгібітори ферментів? Поясніть механізм їх дії.

10. Внаслідок чого відбувається неспецифічне інгібування ферменту?

11. Поясніть механізм інгібуючої дії сульфату міді на активність ферменту. До якого типу інгібіторів він належить?

12. Поясніть механізм впливу кип’ятіння на активність ферменту. Запропонуйте інші методи інактивації амілази.

13. Визначте основні одиниці вимірювання ферментативної активності.

14. Що таке питома активність ферменту? Для чого її визначають?

Література: [1; 4—7].