ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

3. АМИНОКИСЛОТЫ, ПЕПТИДЫ И БЕЛКИ

Вопросы и задачи

1. Абсолютная конфигурация цитруллина.

Какую конфигурацию (D или L) имеет выделенный из арбуза цитруллин, формула которого приведена на рисунке? Поясните свой ответ.

2. Связь между кривой титрования и кислотноосновными свойствами глицина.

Раствор глицина (100 мл, концентрация 0,1 М, pH 1,72) титровали 2 М раствором NаОН. В ходе титрования следили за изменениями pH и по результатам измерений построили график (см. ниже). Ключевые точки на графике обозначены цифрами от I до V. Какие из этих точек следует указать в ответе па поставленные ниже вопросы? Поясните свой ответ.

а) Глицин преимущественно находится в форме H₃N-CH₂-COOH.

б) Средний суммарный заряд молекул глицина

в) Половина аминогрупп ионизована.

г) Значение pH равно значению рКa карбоксильной группы.

д) Значение pH равно значению рК_а протонированной аминогруппы.

е) Глицин обладает максимальной буферной емкостью.

ж) Средний суммарный заряд молекул глицина равен нулю.

з) Карбоксильная группа полностью оттитрована (первая точка эквивалентности).

и) Глицин полностью оттитрован (вторая точка эквивалентности).

к) Глицин преимущественно находится в форме ⁺H3N-CH₂-COO-.

л) Средний суммарный заряд молекул глицина равен -1.

м) Половина молекул глицина преимущественно находится в форме ⁺H₃N-CH₂-COOH, а половина — в форме ⁺H₃N-CH₂ СОО-.

н) Какова изоэлектрическая точка глицина?

о) В какой точке титрование завершено?

п) Укажите области с минимальной буферной емкостью глицина.

3. Какую долю от всех молекул составляют полностью незаряженные формы аланина?

При значении pH, совпадающем со значением изоэлектрической точки аланина, суммарный заряд молекулы равен нулю. На рисунке представлено две структуры, каждая из которых в целом не имеет заряда, однако преобладающей формой аланина при pH = рl является цвиттерион.

а) Почему при pH = рl аланин преимущественно находится в форме цвиттер-иона, а не незаряженной частицы?

б) Какая доля молекул аланина не несет заряда в изоэлектрической точке? Поясните свой ответ.

4. Состояние ионизации аминокислот.

Каждая ионизируемая группа аминокислоты может находиться в одном из двух состояний — заряженном или нейтральном. Электрический заряд на функциональной группе определяется соотношением между значениями pH раствора и рKa данной группы. Данное соотношение описывается уравнением Хендерсона Хассельбаха.

а) Гистидин имеет три ионизируемые функциональные группы. Напишите уравнения для трех соответствующих процессов ионизации и укажите приблизительные значения рКaдля каждой реакции. Нарисуйте структуру гистидина во всех состояниях ионизации. Какой суммарный заряд несет молекула гистидина в каждом из этих состояний?

б) Нарисуйте ионные структуры гистидина, преобладающие при pH 1, 4, 8 и 12. Учтите, что состояние ионизации можно определить, рассматривая каждую ионизируемую группу независимо от остальных.

в) Каков суммарный заряд молекулы гистидина при pH 1, 4, 8 и 12? Куда будет двигаться молекула гистидина в электрическом поле при каждом из этих значений pH — к катоду (-) или к аноду (+)?

5. Разделение аминокислот методом ионообменной хроматографии.

Анализ смеси аминокислот начинают с разделения этой смеси на компоненты с помощью ионообменной хроматографии. После нанесения на колонку с катионообменной смолой, содержащей группы -SO_3-(рис. 3-17, я), аминокислоты движутся вниз по колонке с разной скоростью, поскольку на их движение оказывают влияние два фактора: 1) притяжение между -SO₃- группами носителя и положительно заряженными функциональными группами аминокислот; 2) гидрофобные взаимодействия между боковыми цепями аминокислот и сильно гидрофобной полистиреновой основой носителя. Для каждой из приведенных ниже пар аминокислот определите, какая аминокислота будет сходить с колонки первой при промывании колонки буфером с pH 7,0.

а) Asp и Lys

б) Arg и Met

в) Glu и Val

г) Gly и Leu

д) Ser и Ala

6. Обозначение стереоизомеров изолейцина.

Структурная формула аминокислоты изолейцина изображена ниже.

а) Сколько хиральных центров имеет молекула изолейцина?

б) Сколько оптических изомеров может быть у изолейцина?

в) Нарисуйте пространственные формулы для всех оптических изомеров изолейцина.

7. Сравнение значений рK_а аланина и полиаланина.

Кривая титрования аминокислоты аланина отражает наличие двух ионизируемых функциональных групп с рК_а 2,34 и 9,69, что отвечает соответственно ионизации карбоксильной и протонированной аминогруппы. Кривые титрования ди-, три- и олигопептидов аланина также демонстрируют наличие только двух ионизируемых групп, хотя их экспериментально определенные значения рК_а отличаются от рК_а функциональных групп аланина (см. табл.).

а) Нарисуйте структурную формулу Ala-Ala Ala. Укажите функциональные группы в этой молекуле, которым соответствуют рK₁ и рК₂.

б) Почему с добавлением каждого следующего остатка аланина значение рК₁ возрастает?

в) Почему с добавлением каждого следующего остатка аланина значение рК₂ снижается?

8. Размеры белков.

Чему приблизительно равна молекулярная масса белка, состоящего из 682 аминокислотных остатков, соединенных в единственную полипептидную цепь?

9. Число остатков триптофана в бычьем сывороточном альбумине.

Количественный анализ аминокислот показал, что бычий сывороточный альбумин (БСА) содержит 0,58% (по массе) триптофана (Мr =204).

а) Рассчитайте минимальную молекулярную массу БСА (т. е. считайте, что в молекуле белка содержится только один остаток триптофана).

б) В соответствии с результатами гель- фильтрации молекулярная масса БСА равна 70 000. Сколько остатков триптофана содержится в его молекуле?

10. Субъединичный состав белка.

По данным гель-фильтрации молекулярная масса белка составляет 400 кДа. В результате проведения электрофореза в геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) были обнаружены три белковые полосы, соответствующие белкам с массой 180, 160 и 60 кДа. В присутствии SDS и дитиотрейтола также обнаружены три полосы, на этот раз соответствовавшие белкам с молекулярной массой 160,90 и 60 кДа. Определите субъединичный состав белка.

11. Суммарный электрический заряд молекулы пептида.

Пептид имеет последовательность Glu-IIis-Trp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly.

а) Каков суммарный заряд этой молекулы при pH 3,8 и 11? (Используйте значения рКa для функциональных групп боковых цепей, а также концевых карбоксильной и аминогруппы, приведенные в табл. 3-1.)

б) Оцените значение рl этого пептида.

12. Изоэлектрическая точка пепсина.

Пепсинами называют группу пищеварительных ферментов, секретируемых в виде более крупных белков-предшественников железами желудка. Эти железы, кроме того, выделяют соляную кислоту, которая растворяет присутствующие в пище частицы и тем самым позволяет пепсину расщеплять отдельные молекулы белка ферментативным путем. Образовавшаяся смесь пищи, НС1 и пищеварительных ферментов, известная как пищевая кашица или химус, имеет значение pH около 1,5. Каким должно быть значение р/ пепсина? Какие функциональные группы должны содержаться в пепсине, чтобы обеспечивать ему такое значение рl? Какие аминокислоты в белках содержат такие группы?

13. Изоэлектрическая точка гистонов.

Гистоны - это белки, содержащиеся в ядре эукариотической клетки и прочно свзанные с молекулами ДНК, которые богаты фосфатными группами. Значение рl гистонов очень высокое — около 10,8. Какие аминокислотные остатки должны в большом количестве содержаться в молекулах гистонов? Каким образом эти остатки обеспечивают прочное связывание гистонов с ДНК?

14. Растворимость полипептидов.

Один из методов разделения полипептидов основан на различии в их растворимости. Растворимость крупных полипептидов в воде зависит от относительной полярности их R-групп, в частности от числа ионизируемых групп: чем больше ионизируемых групп имеет полипептид, тем легче он растворяется в воде. Который полипептид из каждой приведенной ниже пары обладает лучшей растворимостью при указанном значении pH?

а) (Gly)₂₀или (Glu)₂₀при pH 7,0

б) (Lys-Ala)₃или (Phe-Met)₃при pH 7,0

в) (Ala-Ser-Gly)₃или (Asn-Ser-His)₅при pH 6,0

г) (Аlа-Аsр-Сlу)₅или (Аsn-Ser-His), при pH 3,0

15. Очистка фермента.

Биохимик исследует и выделяет новый фермент. Результаты проведенной очистки сведены в таблицу.

а) Из приведенных в таблице данных рассчитайте удельную активность фермента после каждой стадии очистки.

б) Какая из стадий очистки была наиболее эффективной (т. е. позволила достичь наибольшего относительного увеличения чистоты)?

в) Какая из стадий была наименее эффективной?

г) Есть ли в приведенных данных какие- либо указания на то, что после стадии 6 белок полностью очищен? Что еще нужно сделать, чтобы оценить чистоту ферментативного препарата?

16. Диализ.

Очищенный белок получен в буфере Нереs (N-(2-гидроксиэтил) пиперазин- N′-(2-этансульфоновая кислота)), pH 7, содержащем 500 мМ NаСl. Образец раствора белка (1 мл) помещают в диализный мешок и диализуют против 1 л того же буфера, но без NаСl. Небольшие молекулы и ионы (такие как Nа⁺, Сl^- и Нереs) могут проходить сквозь мембрану, а белок не может.

а) Какова концентрация NaСl в образце белка после установления диализного равновесия? Считайте, что в процессе диализа объем раствора белка не изменяется.

б) Какой была бы концентрация соли в растворе белка, если бы тот же образец белка объемом 1 мл диализовали последовательно дважды относительно 100 мл того же буфера Hepes?

17. Очистка пептида.

Три пептида с указанным ниже аминокислотным составом смывают с колонки, заполненной катионообменной смолой, при pH 7,0. В каком порядке пептиды будут сходить с колонки?

Пептид A: Ala 10%, Glu 5%, Ser 5%, Leu 10%, Arg10%, His 5%, Ile 10%, Phe 5%, Tyr 5%, Lys 10%, Gly 10%, Pro 5% и Trp 10%.

Пептид В: Ala 5%, Val 5%, Gly 10%, Asp 5%, Leu 5%, Arg 5%, Ile 5%, Phe 5%, Tyr 5%. Lys 5%, Trp 5%, Ser 5%, Thr 5%, Glu 5%, Asn 5%, Pro 10%, Met 5% и Cys 5%.

Пептид C: Ala 10%, Glu 10%, Gly 5%, Leu 5% Asp 10%, Arg 5%, Met 5%, Cys 5%, Tyr 5%, Phe 5%, His 5%, Val 5%, Pro 5%, Thr 5%, Ser 5%, Asn 5% и Gin 5%.

18. Определение последовательности пептида лейэнкефалина, выделенного из мозга.

Из нормальной мозговой ткани была выделена группа пептидов, влияющих на передачу нервного импульса в некоторых отделах мозга. Эти пептиды называют опиоидами, поскольку они связываются со специфическими рецепторами, с которыми также связываются опиаты (алкалоиды опиума), такие как морфин и налоксон. Таким образом, опиоиды имитируют некоторые свойства опиатов. Некоторые ученые рассматривают эти вещества как содержащиеся в мозге собственные средства обезболивания. Используя приведенные ниже данные, определите аминокислотную последовательность опиоида лейэнкефалина. Объясните, как предложенная вами структура согласуется с каждым из результатов (а-в).

а) Полный гидролиз под действием 6 М HCl при 110 °С с последующим анализом аминокислот показал наличие в смеси Gly, Leu, Phe и Туг в молярном соотношении 2:1:1:1.

б) Хроматографический анализ, проведенный после обработки пептида 1-фтор-2,4- динитробензолом и полного гидролиза, выявил наличие 2,4-динитрофенильного производного тирозина. При этом свободного тирозина обнаружено не было.

в) Полное расщепление пептида под действием пепсина и проведенное затем хроматографическое разделение показали наличие дипептида, содержащего остатки Phe и Leu, и трипептида, содержащего Туг и Gly в соотношении 1:2.

19. Структура полипептидного антибиотика, выделенного из Bacillus brevis.

Экстракты, полученные из бактериальной культуры Bacillus brevis, содержат пептид, обладающий свойствами антибиотика. Этот пептид образует комплексы с ионами металлов и, по-видимому, нарушает систему ионного транспорта через клеточную мембрану у других видов бактерий, что приводит к их гибели. Структуру пептида установили на основании приведенных ниже результатов.

а) Полный кислотный гидролиз полипептида с последующим анализом аминокислот продемонстрировал наличие эквимолярных количеств Leu, Orn, Phe, Pro и Val. Orn — это сокращенное обозначение аминокислоты орнитина, не встречающейся в белках, но присутствующей в некоторых пептидах. Орнитин имеет такую структуру:

б) Молекулярная масса пептида оказалась приблизительно равна 1200.

в) Пептид не подвергался гидролизу при обработке ферментом карбоксипептидазой. Этот фермент катализирует отщепление любых С-концевых остатков, за исключением остатка Pro, а также за исключением тех случаев, когда остаток по какой-либо причине не содержит свободной карбоксильной группы.

г) Обработка исходного пептида 1-фтор-2,4- динитробензолом с последующим полным гидролизом и хроматографическим разделением показали наличие только свободных аминокислот и производного следующего строения:

(Подсказка: учтите, что 2,4-динитрофенильная группа присоединена не как обычно к α-атому азота, а к аминогруппе боковой цепи.)

д) Частичный гидролиз пептида, хроматографическое разделение продуктов и их аминокислотный анализ выявили наличие ди- и три- пептидов следующего строения (аминоконцевые остатки всегда расположены слева): Lеu-Рhе Рhе-Рго Оrn-Leu Val-Оrn, Val-Оrn-Leu Рhе-Рrо-Val Рго-Val-Оrn. Используя данную информацию, определите аминокислотную последовательность пептидного антибиотика. Поясните ваши рассуждения. Объясните, как предложенная вами структура согласуется со всеми экспериментальными данными.

20. Эффективность секвенирования пептидов.

Пептид с первичной структурой Lys-Аrg-Рго-Leu-Ilе-Asp-Gly-Аlа секвенировали по методу Эдмана. Каждая стадия цикла проведена с эффективностью 96%. Определите, какую часть всех аминокислот, высвобожденных в четвертом цикле, составляет лейцин? Каким будет это значение при эффективности каждого цикла 99%?

21. Сравнение последовательностей.

Белки, называемые молекулярными шаперонами (см. гл. 4), участвуют в процессе укладки (фолдинга) белков. Белки одного класса шаперонов, обнаруженные в организмах от бактерий до млекопитающих, называют белками теплового шока 90 (Нsр90). Все шапероны Нsр90 содержат 10 характерных аминокислотных последовательностей, которые позволяют легко идентифицировать эти белки в базе данных. Два примера таких последовательностей представлены ниже.

а) Какая аминокислота в данной последовательности инвариантна (сохраняется во всех видах организмов)?

б) В какой позиции (каких позициях) располагаются только аминокислоты с положительно заряженными боковыми цепями? Для каждой из этих позиций определите, какая аминокислота встречается чаще других.

в) В какой позиции (каких позициях) располагаются только аминокислоты с отрицательно заряженными боковыми цепями? Для каждой из этих позиций определите, какая аминокислота встречается чаще других.

г) В какой позиции может находиться любая аминокислота (хотя одна аминокислота все же встречается намного чаще других)? Что это за позиция и какая аминокислота встречается здесь чаще остальных?

22. Биохимический протокол: ваша первая очистка белка.

Придя впервые работать в биохимическую лабораторию, первые несколько недель вы учитесь мыть посуду и подписывать пробирки. Затем вам доверяют готовить буферные и запасные растворы, необходимые для различных лабораторных нужд. Наконец, вы берете на себя ответственность за очистку первого белка. Это цитратсинтаза — фермент цикла лимонной кислоты, локализованный в митохондриях. Вы выполняете все перечисленные ниже стадии, следуя известному протоколу очистки. Руководящий вами более опытный студент на каждой стадии очистки задает вопросы относительно смысла проведения этой стадии. Дайте ему ответы. (Подсказка: информацию об осмолярности см. в гл. 2; информацию о выделении клеточных органелл см. с. 23).

а) На ближайшей бойне вы получили 20 кг бычьих сердец. Вы перевозили их во льду и каждую стадию очистки также выполняли на льду или в холодной комнате. С помощью специального гомогенизатора вы гомогенизировали сердца при pH 7,2 в буфере, содержащем 0,2 М сахарозу. Почему в качестве исходного материала вы используете сердце быка и в таком большом количестве? Почему ткань нужно хранить на льду и разрушать при pH 7,2 в присутствии сахарозы? Что происходит с тканью при гомогенизации?

б) Вы подвергаете гомогенат ткани (плотный и непрозрачный) дифференциальному центрифугированию. Зачем вы это делаете?

в) Для дальнейших экспериментов вы берете супернатант, который в основном содержит интактные митохондрии. Далее вы подвергаете митохондрии осмотическому лизису. Лизат имеет меньшую плотность, чем гомогенат, но все еще непрозрачен. Он состоит из митохондриальных мембран и внутреннего содержимого митохондрий. К этому лизату вы добавляете хорошо растворимую соль — сульфат аммония — в определенной концентрации, центрифугируете свою смесь, декантируете супернатант и отбрасываете осадок. К супернатанту, который выглядит более прозрачным, чем лизат, вы добавляете следующую порцию сульфата аммония и вновь центрифугируете образец. Но на этот раз вы сохраняете осадок, поскольку в нем содержится интересующий вас белок. Почему нужно добавлять соль дважды?

г) Вы растворяете осадок, полученный при повторном осаждении сульфатом аммония, и проводите диализ в течение ночи против большого объема буфера с pH 7,2. Почему диализный буфер не содержит сульфата аммония? Почему вы используете буфер, а не воду?

д) Раствор после диализа вы наносите на колонку для гель-фильтрации. Следуя протоколу, отбираете первую сошедшую с колонки белковую фракцию и отбрасываете все остальные белки. Наличие белка во фракциях определяете по поглощению раствора в ультрафиолетовой области (при 280 нм). Что означает тот факт, что ваш белок сходит с колонки первым? Почему поглощение при 280 нм является хорошим показателем наличия белка в растворе?

е) Фракцию, отобранную при проведении предыдущей стадии, вы наносите на колонку для катионообменной хроматографии. Вы отбрасываете весь исходный раствор, сошедший с колонки, и начинаете промывать колонку раствором с более высоким значением pH. Первую вышедшую белковую фракцию отбираете. Объясните свои действия.

ж) Вы наносите образец из вашей фракции, которая теперь сильно уменьшилась в размере и выглядит практически прозрачной (возможно имеет розоватый оттенок), на гель для изоэлектрофокусирования. После проведения разделения и окрашивания геля вы видите на нем три широкие полосы. В соответствии с протоколом интересующий вас белок имеет значение рl 5,6. Но вы хотите подтвердить чистоту белка еще одним методом. Вы вырезаете из геля полосу с рl 5,6 и помещаете на полиакриламидный гель для проведения электрофореза в присутствии SDS. Почему вы не уверены в чистоте белка, находящегося в отобранной вами полосе? Что вам могут сказать результаты SDS-электрофореза? Почему важно проводить SDS-электрофорез после изоэлектрофокусирования?

Анализ экспериментальных данных

23. Определение аминокислотной последовательности инсулина.

На рис. 3-24 представлена аминокислотная последовательность гормона инсулина. Его структура была определена Фредериком Сенгером с сотрудниками. Большая часть этой работы опубликована в журнале Biochemical Journal в период с 1945 по 1955 г.

Когда Сенгер с сотрудниками начали этот цикл работ, было известно, что инсулин представляет собой небольшой белок, состоящий из двух или четырех полипептидных цепей, соединенных дисульфидными мостиками. Ученым удалось разработать несколько простых методов для изучения последовательности белка.

Обработка FDNB. FDNB (1-фтор-2,4- динитробензол) реагирует со свободными аминогруппами (но не с амидо- или гуанидиногруппами) белка, образуя динигрофенильные (DNP) производные аминокислот:

Кислотный гидролиз. Кипячение белка с 10%-й HCl на протяжении нескольких часов приводит к гидролизу всех пептидных и амидных связей. При краткой обработке образуются короткие пептиды; чем дольше обработка, тем полнее расщепление белка на составляющие его аминокислоты.

Окисление цистеина. При обработке белка надмуравьиной кислотой происходит расщепление всех дисульфидных связей, а все остатки цистеина превращаются в остатки цистеиновой кислоты (рис. 3-26).

Бумажная хроматография. Эта наиболее примитивная версия тонкослойной хроматографии (см. рис. 10-24) предназначена для разделения веществ на основании различия их химических свойств и позволяет идентифицировать отдельные аминокислоты и, в некоторых случаях, дипептиды. Тонкослойная хроматография позволяет разделять пептиды более крупного размера.

В своей первой работе (1945 г.) Сенгер обработал инсулин FDNB, а затем подверг образовавшийся продукт гидролизу. Он обнаружил много свободных аминокислот, но лишь три DNP-нроизводных: α-DNP-глицин (DNP присоединен к a-аминогруппе аминокислоты), α-DNP-фенилаланин и ε-DNP-лизин (DNP присоединен к ε-аминогруппе). Сенгер интерпретировал этот результат таким образом, что инсулин состоит из двух белковых цепей: одна имеет на N-конце Gly, а другая имеет на N-конце Phe. Одна из двух цепей, кроме того, содержит остаток Lys, но не на N-конце. Сенгер назвал цепь, начинающуюся с остатка Gly, цепью А, а цепь, начинающуюся с остатка Phe, цепью В.

а) Объясните, как Сенгер пришел к этим выводам.

б) Соответствуют ли данные результаты известной на сегодняшний день структуре инсулина (рис. 3-24)?

В более поздней статье (1949 г.) Сенгер описывал, как данный метод позволил ему определить несколько аминокислотных остатков в начале каждой цепи инсулина (с N-конца). Например, при анализе последовательности цепи В он проделал следующие шаги.

1. Окисление инсулина для разделения цепей А и В.

2. Приготовление чистого образца цепи В с помощью бумажной хроматографии.

3. Проведение реакции цепи В с FDNB.

4. Мягкий кислотный гидролиз продукта с целью получения нескольких коротких пептидов.

5. Разделение DNP-производных пептидов от пептидов, не содержащих DNP-гpyпп.

6. Выделение четырех DNP-пeптидoв, названных В1, В2, В3 и В4.

7. Полный гидролиз каждого DNP-пeптида с целью получения свободных аминокислот.

8. Идентификация продуктов гидролиза каждого пептида с помощью бумажной хроматографии.

Были получены следующие результаты:

В1: только α-DNP-фенилаланин;

В2: α-DNP-фенилаланин и валин;

В3: аспарагиновая кислота, α-DNP- фенилаланин и валин;

В4: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, α-DNP-фенилаланин и валин

в) Основываясь на этих результатах, назовите четыре первые аминокислоты на N-конце пептида В. Объясните свои рассуждения.

г) Согласуются ли эти результаты с известной последовательностью инсулина (рис. 3-24)? Объясните все несоответствия.

Сенгер с коллегами использовали свой метод для определения полной последовательности цепей А и В. Они установили следующую последовательность А цепи (N-конец расположен слева):

Поскольку при кислотном гидролизе все остатки Asn превращаются в Asp, а все остатки Gln — в Glu, эти остатки пришлось обозначить Asx и Glx соответственно (точно их идентифицировать было невозможно). Сенгер решил эту проблему, разбив последовательности на короткие пептиды с помощью протеаз, расщепляющих пептидные связи, но не расщепляющих амидные связи в остатках Asn и Gin. Далее он определил число амидных групп в каждом пептиде, измеряя концентрацию NH₄⁺, выделяющегося при кислотном гидролизе пептида. Ниже представлены некоторые результаты, полученные для цепи А. Возможно, пептиды не были полностью свободны от примесей, так что эти цифры не абсолютно точные, но достаточно точные для решения поставленной Сенгером задачи.

д) На основании этих данных определите аминокислотную последовательность цепи А. Объясните свой ответ и сравните его с данными, представленными на рис. 3-24.