ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

6. ФЕРМЕНТЫ

6.3. Ферментативная кинетика как подход к пониманию механизма действия ферментов

Существует несколько методов изучения механизмов действия ферментов. Знание трехмерной структуры белка снабжает исследователей очень важной информацией, ценность которой еще более возрастает при использовании подходов классической белковой химии и современных методов сайт-направленного мутагенеза (направленного изменения аминокислотной последовательности белка генно-инженерным путем, рис. 9-11). Данные технологии позволяют биохимикам изучать роль отдельных аминокислот в структуре и функциях фермента. Однако основной подход к изучению механизма ферментативной реакции заключается в определении скорости реакции и ее изменений в ответ на изменение внешних параметров, т. е. в изучении ферментативной кинетики реакций. Этот самый старый подход к исследованию механизмов ферментативных реакций остается наиболее важным. Мы остановимся на основных закономерностях ферментативной кинетики. Цитируемые в конце главы источники позволят более подробно изучить данный предмет.

Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата

Основным фактором, влияющим на скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата [S]. Изучение влияния концентрации субстрата затрудняется тем, что эта концентрация меняется в ходе реакции in vitro по мере того, как субстрат превращается в продукт реакции. Один из подходов к решению данной проблемы в экспериментальной кинетике заключается в определении начальной скорости процесса, обозначаемой v₀ (рис. 6-10). В типичной реакции фермент присутствует в наномолярной концентрации, тогда как концентрация субстрата на пять или шесть порядков выше. В начальный момент реакции (часто не более 60 с) концентрация субстрата изменяется нс более чем на несколько процентов, так что [S] считают постоянной величиной. В таком случае можно представить v₀ как функцию от концентраций субстрата, выбираемых самим исследователем. Влияние [S] на v₀ при постоянной концентрации фермента продемонстрировано на рис. 6-11. При сравнительно низких концентрациях субстрата v₀ растет почти линейно с ростом [S]. При более высоких значениях [S] рост v₀ замедляется. Наконец, достигается точка, после которой увеличение [S] приводит лишь к пренебрежимо малому увеличению значений v₀, т. е. начальная скорость реакции приближается к максимальной скорости (Vm_ax).

Рис. 6-10. Начальная скорость ферментативных реакций. Гипотетический фермент катализирует реакцию S ⇄ Р, присутствуя в концентрации, достаточной для достижения максимальной скорости V_mах = 1 М/мин. Константа Михаэлиса КM (ее определение см. в тексте) составляет 0,5 мкМ. На графике представлены кривые, соответствующие ходу реакции при концентрации субстрата, которая ниже значения К_м, равна или выше него. Скорость ферментативной реакции снижается по мере превращения субстрата в продукт. Угол наклона касательной, проведенной к каждой кривой в момент времени t = 0, соответствует начальной скорости V₀.

Рис. 6-11. Влияние концентрации субстрата на начальную скорость ферментативной реакции. Максимальную скорость Vm_ах можно определить из данного графика путем экстраполяции, поскольку она никогда не достигается. Концентрация субстрата, при которой v₀ соответствует половине максимальной скорости, называется константой Михаэлиса (К_м). Концентрация фермента в экспериментах данного типа обычно настолько мала что соблюдается соотношение [S]» [Е], даже если концентрацию субстрата считают невысокой. Единицы измерения, приведенные на рисунке, являются типичными для ферментативных реакций и представлены здесь для того, чтобы помочь читателю понять смысл параметров v₀ и [S]. Заметьте, что данная кривая описывает лишь часть гиперболы с одной асимптотой при V_mах. Если продлить эту кривую ниже значения [S] = 0, она приблизится к вертикальной асимптоте при [S] = -КM.

Для понимания подобного кинетического поведения системы необходимо учитывать образование фермент-субстратного комплекса ES. На основании зависимости, представленной на рис. 6-11, в 1903 г. Виктор Анри, продолжавший работы Вюрца, предположил, что необходимой стадией ферментативной реакции является взаимодействие фермента с субстратом, приводящее к образованию комплекса ЕS. Эта идея была развита в общей теории ферментативного катализа, сформулированной в 1913 г. Леонором Михаэлисом и Мод Ментен. В данной теории постулируется, что сначала происходит быстрая обратимая реакция образования фермент-субстратного комплекса:

(6-7)

Затем комплекс ЕS с меньшей скоростью распадается на свободный фермент и продукт реакции Р:

(6-8)

Поскольку более медленная вторая реакция лимитирует общую скорость процесса, общая скорость должна быть пропорциональна концентрации веществ, реагирующих на этой стадии, т. е. ЕS.

В любой момент времени в ходе ферментативной реакции фермент присутствует в двух формах — в свободной форме Е и в комплексе с ферментом ЕS. При низкой концентрации субстрата большая часть фермента находится в свободной форме (Е). При этом скорость реакции пропорциональна [S], поскольку равновесие, описываемое уравнением 6-7, по мерс роста [Б] сдвигается в сторону образования ЕS. Максимальная скорость ферментативной реакции (Vmах) достигается, когда практически весь фермент связан в комплексе ЕS, а концентрация свободного фермента пренебрежимо мала. При этом фермент «насыщается» своим субстратом, так что дальнейшее увеличение [S] не влияет на скорость реакции. Данное состояние наблюдается, когда [S] достаточно велико, и весь свободный фермент переводится в форму ЕS. В результате распад комплекса ЕS происходит образование продукта Р и высвобождение свободного фермента, готово го катализировать превращение новой молекула субстрата. Эффект насыщения является отличительной чертой ферментативного катализа; именно насыщением объясняется плато на рис. 6-11. Тип зависимости, изображенный на рис. 6-11 иногда называют кинетикой насыщения.

При смешивании фермента с избытком субстрата наблюдается так называемое предстационарное состояние, в котором происходит рост концентрации комплекса ЕS. Этот период обычно слишком краток (несколько микросекунд) так что его нелегко зафиксировать в условиях эксперимента, и он не виден на рис. 6-10. Реакция быстро переходит в стационарное состояние, при котором концентрация ЕS (и любых других интермедиатов) практически нс меняется со временем. Концепция стационарного состояния была предложена Г Э. Бриггсом и Дж. Б. С. Холдейном в 1925 г. Измеряемое значение v₀ обычно соответствует стационарному состоянию, даже если определяется на ранних этапах реакции, поэтому метод анализа начальных скоростей называется стационарной кинетикой.

Количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью реакции

Зависимость между [R] и v₀ (рис. 6-11) для большинства ферментов имеет один и тот же вид (стремится к равнобочной гиперболе), и ее алгебраическим выражением является уравнение Михаэлиса-Ментен. Михаэлис и Ментен вывели свое уравнение, опираясь все на тот же постулат, что лимитирующая стадия ферментативной реакции — распад комплекса ЕS с образованием продукта и высвобождением фермента. Уравнение выглядит следующим образом:

(6-9)

Параметры [S], v₀ и V_mах, а также константа Михаэлиса (К_м) являются важными характеристиками реакции и могут быть определены экспериментально.

Теперь рассмотрим подробнее основные логические и алгебраические этапы вывода уравнения Михаэлиса-Ментен с учетом приближений стационарной кинетики, введенных Бриггсом и Холдейном. Для вывода уравнения запишем две основные схемы реакций, соответствующие образованию и распаду комплекса ЕS (уравнения 6-7 и 6-8). На начальных этапах реакции концентрация продукта [Р] ничтожно мала, что позволяет пренебречь скоростью обратной реакции Р —> S (характеризуется константой r-₂). Это предположение нс является критическим, но сильно упрощает нашу задачу. В результате общее уравнение реакции примет следующий вид:

(6-10)

Скорость v₀ определяется распадом комплекса ЕS и зависит от [ЕS]:

v₀ = r2[ЕS] (6-11)

Поскольку [ЕS] сложно определить экспериментально, следует выразить этот параметр каким- то другим образом. Прежде всего, введем параметр [Еr], отражающий общую концентрацию фермента (сумму концентраций связанного в комплекс ЕS и свободного фермента). Тогда концентрацию свободного фермента можно определить, как [Еt] — [ЕS]. Аналогичным образом, поскольку обычно [S]» [Еt], то в любой момент времени количество субстрата, связанного в комплекс с ферментом, пренебрежимо мало по сравнению с общей концентрацией S. Помня об этом, выразим v₀ через определяемые в эксперименте параметры.

Скорости образования и распада комплекса ЕS определяются стадиями процесса с константами r₁ (образование) и r₁ + r₂ (распад) в соответствии с выражениями:

Скорость образования ЕS = r₁ ([Е_t] — [ЕS]) [S] (6-12)

Скорость распада ЕS = r₁ [ЕS] + r₂ [ЕS] (6-13)

Теперь нам предстоит сделать важное допущение: начальная скорость реакции соответствует стационарному состоянию, при котором концентрация ЕS постоянна, т. е. скорость образования ЕS равна скорости его распада.

Математически это выражается следующим образом:

r₁ ([E_t] - [ES]) [S] = r_-1[ES] + r₂[ES] (6-14)

Теперь перейдем к решению уравнения (6-14) относительно [ES]. Сначала раскроем скобки в левой части уравнения и вынесем за скобки [ES] в правой части:

r₁ [Е_t] [S] - r₁ [ES] [S] = (r₁ + r₂) [ES] (6-15)

Прибавив к обеим частям уравнения выражение r₁ [ES] [S] и упростив уравнение, получим следующее:

r₁[E_t][S]-(r₁[S]+r_-1 + r₂)[ES] (6-16)

Теперь решим это уравнение относительно [ES]:

(6-17)

Уравнение можно упростить, объединив все константы скоростей:

(6-18)

Выражение (r_-1 + r₂) / r₁ называют константой Михаэлиса и обозначают К_м. Подставляя К_м в уравнение 6-18, получаем

(6-19)

Теперь можно выразить скорость v₀ через [ЕS]. Подставляя правую часть уравнения 6-19 вместо [ЕS] в уравнении 6-11, получаем:

(6-20)

Данное уравнение можно упростить. Поскольку при насыщении фермента (т. е. при [ЕS] = [Е_t]) достигается максимальная скорость реакции, то V_mах можно определить, как r₂[Е_t]. Подставляя это в уравнение 6-20, получаем уравнение 6-9:

Это и есть уравнение Михаэлиса-Ментен, т. е. уравнение скорости односубстратной ферментативной реакции. Оно выражает количественное соотношение между начальной скоростью реакции v₀, максимальной скоростью V_mах и исходной концентрацией субстрата [S], которые связаны между собой через константу Михаэлиса К_м. Заметьте, что константа Михаэлиса имеет размерность концентрации. Соответствует ли данное уравнение экспериментальным наблюдениям? Да, соответствует, и это можно показать, рассматривая граничные условия, когда [S] принимает очень большие или очень малые значения (рис. 6-12).

Рис. 6-12. Зависимость начальной скорости от концентрации субстрата. На графике отражены кинетические параметры, ограничивающие данную кривую при высоких и низких значениях [S]. При низких значениях концентрации субстрата КM» [S], и значением [S] в знаменателе уравнения 6-9 можно пренебречь. В таком случае уравнение приводится к виду v₀ = V_mах [S]/ К_M, и v₀ линейным образом зависит от [S], как и следует из рисунка. При высоких значениях [S] наблюдается соотношение К_M «[S]; в таком случае в знаменателе уравнения 6-9 можно пренебречь значением К_м и привести уравнение к виду v₀ = V_mах. Это состояние соответствует плато на графике при высоких значениях [S]. Таким образом, уравнение Михаэлиса-Ментен согласуется с экспериментальной зависимостью v₀ от [S], а форма кривой ограничивается значением V_mах/ К_M при низких концентрациях субстрата и значением Vm_ах при высоких концентрациях субстрата.

Преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен: двойные обратные координаты

Уравнение Михаэлиса-Ментен

можно преобразовать алгебраическим способом в другую форму, более удобную для анализа экспериментальных данных. Одно из наиболее часто используемых преобразований состоит в том, что обе части уравнения переворачивают, что приводит уравнение к следующему виду:

Разделив числитель в правой части уравнения на составляющие, получаем

и в результате упрощения приходим следующему:

Данная форма записи уравнения Михаэлиса-Ментен называется уравнением Лайнуивера-Берка. Для ферментов, подчиняющихся кинетике Михаэлиса- Ментен, график зависимости 1 /v₀ от 1/S] (в двойных обратных координатах по отношению к использованным ранее координатам v₀ от [S]) представляет собой прямую линию (рис. 1). Угол наклона прямой равен К_м/ V_mах; точка пересечения прямой с осью ординат соответствует 1/V_mах, а точка пересечения с осью абсцисс соответствует -1 /К_м. График в двойных обратных координатах, называемый также графиком Лайнуивера- Берка, позволяет более точно определить величину V_mах, которую в обычных координатах v₀ от [S] можно оценить лишь приблизительно (см. рис. 6-12).

Рис. 1. График в двойных обратных координатах (график Лайнуивера-Берка).

Существуют и другие способы преобразования уравнения Михаэлиса-Ментен, причем каждый из них имеет определенные преимущества для анализа экспериментальных данных (см. задачу 14 в конце данной главы).

Графики в двойных обратных координатах чрезвычайно полезны для выявления различий в механизмах ферментативного катализа (см. рис. 6-14) и анализа ингибирования ферментативных реакций (дон. 6-2).

Важное численное соотношение, вытекающее из уравнения Михаэлиса-Ментен, наблюдается в частном случае, когда начальная скорость равна половине максимальной скорости (рис. 6-12):

(6-21)

Разделив обе части уравнения на V_maх, получаем:

(6-22)

Решим это уравнение относительно К_м. Получим К_м ⁺ [S] = 2[S] или

(6-23)

Это определение К_м очень важно для практического использования: константа Михаэлиса соответствует концентрации субстрата, при которой начальная скорость реакции равна половине максимальной скорости.

Уравнение Михаэлиса-Ментен (уравнение 6-9) алгебраическим путем можно преобразовать к виду, удобному для практического определения К_м и V_mах (дои. 6-1), а также для анализа действия ингибиторов (доп. 6-2 на с. 296).

Использование кинетических параметров для сравнения активностей ферментов

Важно понимать различие между уравнением Михаэлиса-Ментен и тем частным кинетическим механизмом, для которого оно исходно было получено. Данное уравнение описывает кинетическое поведение огромного большинства ферментов, и про все ферменты с гиперболической зависимостью v₀ от [S] говорят, что они подчиняются кинетике Михаэлиса-Ментен. Практическое правило, что К_м = [S] при v₀= 1/2 V_mах (уравнение 6-23), соблюдается для всех ферментов, подчиняющихся кинетике Михаэлиса-Ментен. Наиболее важным исключением являются регуляторные ферменты, не подчиняющиеся этой кинетике (разд. 6.5). Однако уравнение Михаэлиса-Ментен описывает не только сравнительно простой двухстадийный механизм ферментативной реакции, предложенный Михаэлисом и Ментен (уравнение 6-10). Многие ферменты, подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен, имеют совсем другой механизм действия, например, ферменты, катализирующие реакции с шестью или восемью идентифицируемыми стадиями. Хотя уравнение 6-23 справедливо для многих ферментов, порядок и значение констант К_м и V_max для разных ферментов различны. В этом заключается важное ограничение использования условий стационарности для анализа ферментативной кинетики. Для данного фермента значения Км и V_mах можно определить экспериментальным путем, однако сами по себе они почти ничего не говорят о количестве стадий реакции, их скорости и химической природе. Тем не менее анализ данных стационарной кинетики позволяет определять каталитическую активность ферментов и сравнивать их между собой.

Интерпретация значений К_м и V_mах. На рис. 6-12 изображен простой графический метод, позволяющий оценивать значение К_м. Более точные значения можно получить, используя метод двойных обратных координат (доп. 6-1). Численные значения К_м для конкретных ферментов могут очень сильно различаться; более того, могут различаться значения K_м для субстратов одного и того же фермента (табл. 6-6). Константа Михаэлиса иногда (и часто неоправданно) используется как показатель сродства фермента к субстрату. А значение К_м зависит от таких аспектов механизма реакции, как количество и относительные скорости отдельных стадий. Для двухстадийной реакции

(6-24)

Если лимитирующей является вторая стадия реакции, то r₂ «r_-1, и выражение 6-24 упрощается до К_м = r _-1/r₁, что соответствует константе диссоциации комплекса ЕS (K_d). В данных условиях К_м действительно является мерой сродства фермента к субстрату в комплексе ЕS. Однако данная ситуация наблюдается далеко не во всех случаях. Иногда r₂» r_-1, _и при этом К_м = r₂/r₁.

Таблица 6-6. Значения К_M для нескольких ферментов

Фермент	Субстрат	K_м (мМ)
Гексокиназа (из мозга)	АТР D-Глюкоза D-Фруктоза	0,4 0,05 1.5
Карбонгидраза	НСО₃	26
Химотрипсин	Глицил-тирозинил-глицин N-бензоил-тирозинамид	108 2,5
β-Галактозидаза	D-лактоза	4,0
Треониндегифратаза	L-треонин	5,0

В других случаях r-1 и r₂ имеют сравнимые значения, тогда К_м остается более сложной функцией всех трех констант (уравнение 6-24). В подобны> ситуациях уравнение Михаэлиса-Ментен по- прежнему применимо, наблюдается характерная зависимость с насыщением, но только К_м нельзя рассматривать в качестве меры сродства фермента к субстрату. Еще более часто наблюдаются ситуации, при которых после образования комплекса ЕS реакция протекает в несколько стадий; в таких случаях К_м становится сложной функцией нескольких констант.

Значения V_mах также сильно различаются для разных ферментов. Если фермент действует в соответствии с двухстадийным механизмом Михаэлиса-Ментен, то V_mах = k₂[Е_t], где r₂ — константа скорости лимитирующей стадии. Однако число стадий реакции и лимитирующая стадия могут меняться от фермента к ферменту. Рассмотрим, например, довольно распространенную ситуацию, когда лимитирующей стадии соответствует образование продукта, т. е. реакция ЕР —> Е + Р. В начале реакции, когда значение [Р] невелико, суммарная реакция может быть описана следующей схемой:

(6-25)

В данном случае большая часть фермента при насыщении находится в форме ЕР; при этом V_mах = k₃[Е_t]. Для выражения скорости лимитирующей стадии ферментативной реакции с насыщением полезно ввести константу скорости rcat. Если реакция протекает в несколько стадий, одна из которых определенно является лимитирующей, то rcatэквивалентна константе скорости этой лимитирующей стадии. Для простого случая, описываемого уравнением 6-10, rcat = r₂. Для реакции, описываемой уравнением 6-25, r_cat = r₃. Если несколько стадий реакции являются лимитирующими, rcat представляет собой сложную функцию нескольких констант скоростей. В уравнении Михаэлиса-Ментен r_cat = V_mах/ [Е_t], и уравнение 6-9 имеет вид

(6-26)

Константа rcat представляет собой константу скорости реакции первого порядка и, следовательно, имеет размерность, обратную времени. Иначе эту константу называют числом оборотов, поскольку ее значение эквивалентно числу молекул субстрата, превращенных в продукт в единицу времени на одной молекуле фермента при условии насыщения фермента субстратом. Число оборотов некоторых ферментов представлено в табл. 6-7.

Таблица 6-7. Число оборотов (K_cat) некоторых ферментов

Фермент	Субстрат	r_car(c_-1)
Каталаза	Н₂O₂	40 000 000
Карбоангидраза	HCO₃^-	400 000
Ацетилхолин- эксгераза	Ацетилхолин	14 000
β-Лактамаза	Бензилпенициллин	2000
Фумараза	Фумарат	800
Белок RecA (АТРаза)	АТР	0.5

Сравнение каталитических механизмов и эффективности действия ферментов. Параметры r_cat и К_м используют для изучения и сравнения различных ферментов, вне зависимости от сложности механизма их действия. Значения r_cat и К_м каждого фермента отражают условия клеточной среды, концентрацию субстрата в реакциях in vivo, а также химическую сущность катализируемой реакции.

Кроме того, параметры rcat и К_м позволяют оценить каталитическую эффективность фермента, но знания лишь одного из этих параметров недостаточно для решения данных задач. Два фермента, катализирующие различные реакции, могут характеризоваться одинаковыми значениями rcat, хотя скорости тех же реакций без катализатора различаются, следовательно, различается и степень ускорения реакций под действием ферментов. Обычно значение К_м фермента близко к значению концентрации его субстрата в клетке. Фермент, субстрат которого имеет очень низкую концентрацию в клетке, обычно характеризуется более низким значением К_м, чем фермент, субстрат которого имеет более высокую концентрацию.

Наилучшим способом сравнения каталитической активности различных ферментов или воздействия одного и того же фермента на различные субстраты является сопоставление отношений rcat / Км для исследуемых реакций. Этот параметр иногда называют коэффициентом специфичности; он является константой скорости превращения Е + S в Е + Р. При [S| «уравнение 6-26 преобразуется к виду

(6-27)

В данном случае v₀ зависит от концентрации двух реагирующих веществ ([Еt] и [S]); следовательно, это уравнение описывает скорость реакции второго порядка, и ее константа r_cat / К_м является константой скорости реакции второго порядка с единицей измерения М^-1с^-1. Существует верхний предел отношения r_cat/ K_м, который определяется скоростью диффузии Е и S в водном растворе. Этот диффузионный предел составляет 10⁸-10⁹ М^-1с^-1, и многие ферменты характеризуются отношением r_cat / Км, находящимся в этом диапазоне (табл. 6-8). Про такие ферменты говорят, что они достигли «каталитического совершенства». Заметьте, что максимальное соотношение r_cat / K_м возможно при самых разных значениях этих параметров.

Таблица 6-8. Ферменты, для которых параметр к_соt / К_M близок к диффузионному пределу (10⁸-10⁹ М^-1c^-1)

Фермент	Субстрат	r_cat (c_-1)	Kм (М)	r_cat/ К_м (М_-1с_-1)
Ацетилхолинеэстераза	Ацетилхолин	1,4 • 10⁴	9 • 10^-5	1,6 • 10⁸
Карбоангидраза	СО₂ НСО₃	1 • 10⁶ 4 • 10⁵	1,2 • 10^-2 2,6 • 10^-2	8,3 • 10⁷ 1,5 • 10⁷
Каталаза	Н₂О₂	4 • 10⁷	1,1 • 10⁰	4 • 10⁷
Кротоназа	Кротонил СоА	5,7 • 10³	2 • 10^-5	2,8 • 10⁸
Фумараза	Фумарат Малат	8 • 10² 9 • 10²	5 • 10^-6 2,5 • 10^-5	1,6 • 10⁸ 3,6 • 10⁷
β-Лактамаза	Бензилиенициллин	2,0 • 10³	2 • 10^-5	1 • 10⁸

Пример 6-1. Определение константы Михаэлиса К_м

Был исследован фермент, катализирующий следующую химическую реакцию:

грусть ⇄ веселье

Исследователи назвали фермент веселазой. Они обнаружили, что r_саt, для этого фермента составляет 600 с^-1. Было решено поставить несколько экспериментов.

При [Е_t| = 20 нМ и [грусть] = 40 мкМ начальная скорость реакции v₀ равна 9,6 мкМ • с^-1. Найдите значение К_м для субстрата грусть.

Решение. Нам известны значения r_cat, [Е_t], [s] и v₀. Нужно определить K_м. Лучше всего применить уравнение 6-26, а вместо максимальной скорости Vm_ах подставить rcat [Е_t]. Подставляя известные нам величины, получаем значение Км.

Поработав с этим уравнением, вы научитесь легко решать подобные задачи. Например, можно найти значение V_max, зная, что r_cat[E_t] = V_mах (600 с^-1 • 0,020 мкМ = 12 мкМ с^-1в данном случае). Если разделить обе части уравнения 6-26 на V_mах, получим:

Таким образом, отношение v₀/ V_mах = 9,6 мкМ с^-1/12 мкМ с^-1 = [S]/(K_M + [S]).

Это упрощает процесс поиска К_м, приводя нас к значению 0,25 [S) или 10 мкМ.

Пример 6-2. Определение концентрации субстрата

В другом эксперименте по изучению свойств веселазы при концентрации фермента [E_t] = 10 нМ начальная скорость реакции составила 3 мкМ • с^-1. Какой была концентрация субстрата [S] в этом эксперименте?

Решение. Используя ту же логику, что и в примере 6-1, найдем значение максимальной скорости реакции для данной концентрации фермента. Она составляет 6 мкМ • с^-1. Обратите внимание, что начальная скорость v₀ точно соответствует половине Vmax. Вспомните, что по определению константа Михаэлиса K_м равна концентрации субстрата [S], при которой v₀ = 1/2 V_max. Таким образом, в этой задаче [S] = K_м = 10 мкМ. Если бы значение v₀ было отличным от 1/2 V_max, для нахождения концентрации субстрата следовало бы воспользоваться уравнением v₀/ V_mах = [S]/(K_M + [S]).

Многие ферменты катализируют реакции с участием двух и большего числа субстратов

До сих пор мы говорили о том, как концентрация субстрата влияет на скорость простой ферментативной реакции S —> Р с единственным субстратом. Однако в большинстве ферментативных реакций с ферментом связываются и претерпевают превращения два или большее число субстратов. Например, в реакции, катализируемой гексокиназой, АТР и глюкоза являются субстратами, a ADP и глюкозо-6- фосфат — продуктами:

АТР + глюкоза —> ADP + глюкозо-6-фосфат

Скорости подобных двухсубстратных реакций также можно анализировать, используя подход Михаэлиса-Ментен. Как видно из табл. 6-6, гексокиназа характеризуется разными значениями К_м для каждого из субстратов.

Ферментативные реакции с участием двух субстратов обычно идут с переносом атома или функциональной группы с одного субстрата на другой. Такие реакции протекают по одному из нескольких известных механизмов. В некоторых случаях в какой-то момент реакции оба субстрата связываются с ферментом, образуя нековалентный тройной комплекс (рис. 6-13, а), причем субстраты могут связываться с ферментом как в определенном порядке, так и случайным образом. В других случаях сначала первый субстрат превращается в продукт, а лишь затем происходит связывание второго субстрата; тройной комплекс не образуется. Примером является механизм «пинг-понг» (механизм двойного замещения, рис. 6-13, б). Выявить эти механизмы часто помогает стационарная кинетика (рис. 6-14).

Рис. 6-13. Основные механизмы двухсубстратных ферментативных реакций, а) Фермент и два субстрата образуют тройной комплекс. При упорядоченном связывании сначала должен связаться субстрат 1, а лишь затем происходит продуктивное связывание субстрата 2. При неупорядоченном связывании субстраты могут присоединяться к ферменту в любом порядке. б) В данном механизме последовательно происходит образование фермент-субстратного комплекса высвобождение первого продукта связывание измененной формы фермента со вторым субстратом и высвобождение второго продукта и свободного фермента. Субстрат 1 может переносить на фермент функциональную группу (приводя к ковалентной модификации Е — Е′), которая затем переносится на субстрат 2. Это так называемый механизм «пинг-понг», или механизм двойного замещения.

Рис. 6-14. Анализ двухсубстратных реакций методами стационарной кинетики. Данные графики в двойных обратных координатах (доп. 6-1) отражают серию экспериментов, в которой изменяли концентрацию субстрата 1 при постоянной концентрации субстрата 2. Такую серию экспериментов выполнили с разными концентрациями субстрата 2 и получили несколько отдельных линий. а) Пересекающиеся линии указывают на образование тройного комплекса. б) Параллельные линии указывают на то, что реакция протекает по механизму «пинг-понг».

Предстационарная кинетика может дать дополнительную информацию о последовательности стадий реакции

Мы определили кинетику как основной метод изучения последовательности ферментативной реакции и указали на то, что большинство кинетических параметров не могут дать полной информации о течении реакции. Двумя наиболее важными параметрами, определяемыми экспериментально с помощью методов стационарной кинетики, являются величины r_cat и r_cat/ K_M. Колебания этих параметров при изменении pH или температуры могут обеспечить ряд дополнительных данных о стадиях реакции. В случае двухсубстратных реакций стационарная кинетика помогает определить, образуется ли в процессе реакции тройной комплекс (рис. 6-14). Для получения более полной информации обычно требуется применение сложных кинетических методов, описание которых выходит за рамки данного изложения. Мы лишь кратко представим читателю один из наиболее важных кинетических подходов, использующихся для изучения механизмов реакции, — предстационарную кинетику.

Полное описание ферментативной реакции подразумевает непосредственное измерение скоростей отдельных реакционных стадий, например, определение скорости связывания фермента с субстратом с образованием комплекса ЕS. Скорости многих отдельных стадий реакции могут быть определены независимо в предстационарном состоянии (см. с. 287). Условия реакции подбираются таким образом, чтобы можно было проследить за взаимодействием с одной молекулой субстрата. В связи с тем, что предстационарная фаза реакции обычно очень коротка, для проведения такого эксперимента требуются специальные приемы, позволяющие очень быстро производить перемешивание реагирующих веществ и отбор проб. Одной из задач подобного эксперимента является определение полной картины энергетических изменений в процессе реакции. Как мы обсуждали ранее, скорость реакции и равновесие реакции связаны с изменением свободной энергии. Измерение скорости отдельной стадии позволяет понять, как энергия используется специфическим ферментом, что важно для понимания общего механизма реакции. В ряде случаев удается измерить скорость каждой отдельной стадии многостадийной ферментативной реакции. Некоторые примеры использования методов предстационарной кинетики приведены в разд. 6.4.

Ферменты могут подвергаться обратимому и необратимому ингибированию

Ингибиторы ферментов представляют собой соединения, вмешивающиеся в процесс катализа и тем самым замедляющие ферментативные реакции (вещества, которые ускоряют ферментативные реакции, обычно называют активаторами). Ферменты катализируют практически все клеточные процессы, поэтому неудивительно, что ингибиторы ферментов относятся к наиболее важным фармацевтическим препаратам. Например, аспирин (ацетилсалициловая кислота) ингибирует фермент, катализирующий первую стадию синтеза простагландинов, участвующих во многих физиологических процессах, в том числе, в возникновении болевых ощущений. Ингибиторы ферментов являются полезным инструментом для изучения ферментативных механизмов и метаболических путей в клетках. Существует два основных класса ингибиторов ферментов — обратимые и необратимые.

Обратимое ингибирование. Одним из типов обратимого ингибирования является конкурентное ингибирование (рис. 6-15, а). Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание в активном центре фермента. Связывание ингибитора (I) с активным центром препятствует связыванию субстрата. Многие конкурентные ингибиторы имеют сходство с субстратом и образуют с ферментом комплекс ЕI, который, однако, не может осуществлять катализ. Даже кратковременное связывание такого типа будет снижать эффективность действия фермента. Зная молекулярное строение ингибитора, имеющего сходство с субстратом, мы можем судить о том, какие участки молекулы субстрата участвуют во взаимодействии с ферментом. Действие конкурентных ингибиторов можно проанализировать методами стационарной кинетики. В присутствии конкурентного ингибитора уравнение Михаэлиса-Ментен (6-9) примет следующий вид:

(6-28)

где

Уравнение 6-28 отражает важные свойства конкурентного ингибирования. Экспериментально определяемый параметр α К_м, т. е. константу Михаэлиса в присутствии ингибитора, часто называют кажущейся константой Михаэлиса.

Рис. 6-15. Три типа обратимого ингибирования, а) Конкурентный ингибитор связывается в активном центре фермента; связывание ингибитора с ферментом характеризуется константой равновесия (КI). б) Бесконкурентный ингибитор связывается вне активного центра фермента, причем связывание происходит только с уже сформировавшимся комплексом ЕS. Связывание ингибитора с комплексом ЕS характеризуется константой (KI′). в) При смешанном типе ингибирования ингибитор связывается вне активного центра, причем может связываться как с Е, так и с ЕS.

Кинетические методы для определения типа ингибирования

Тип ингибирования легко определить, если по экспериментальным данным построить графики в двойных обратных координатах (доп. 6-1). Проводят две серии экспериментов с постоянной концентрацией фермента. В первой серии используют также постоянную концентрацию субстрата [S], что позволяет измерить влияние роста концентрации ингибитора [I] па начальную скорость v₀ (не показано). Во второй серии экспериментов поддерживают постоянное значение [I| и варьируют [S]. Результаты откладывают на графике в координатах 1/v₀ от 1/[S|.

На рис. 1 в двойных обратных координатах представлена серия экспериментальных данных, полученных без ингибитора и с двумя разными концентрациями ингибитора. Полученные прямые имеют общую точку пересечения на оси 1/v₀, но разные углы наклона. Точка пересечения с осью 1/v₀ соответствует 1/V_max, из чего следует, что значение максимальной скорости нс зависит от присутствия конкурентного ингибитора. Вне зависимости от концентрации конкурентного ингибитора достаточно высокая концентрация субстрата будет вытеснять ингибитор из активного центра фермента. Над графиком приведено уравнение, полученное в результате преобразования уравнения 6-28, с помощью которого данный график был построен. Значение α можно рассчитать на основании угла наклона прямой при любом значении [I]. Зная α и [I], можно рассчитать КI по уравнению α = 1 + [I] / KI.

Рис. 1. Конкурентное ингибирование.

В случае бесконкурентного и смешанного ингибирования графики в тех же координатах образуют семейства кривых, изображенные на рис. 2 и 3. Изменение точек пересечения с осями говорит об изменении параметров V_mах и К_м.

Рис. 2. Бесконкурентное ингибирование.

Рис. 3. Смешанное ингибирование.

Поскольку связывание ингибитора происходит обратимо, усилить связывание субстрата можно, если просто повысить его концентрацию. При [S]» [I] вероятность связывания ингибитора с ферментом уменьшается, и реакция протекает с нормальным значением V_max. Однако в присутствии ингибитора при концентрации субстрата, соответствующей v₀= 1/2 V_mах, кажущееся значение К_м возрастает в α раз. Такое изменение константы Михаэлиса при постоянном значении максимальной скорости является признаком конкурентного ингибирования и легко выявляется при построении графика в двойных обратных координатах (доп. 6-2). Константу равновесия для связывания ингибитора (КI)можно найти из того же графика.

■ Лечение людей, принявших внутрь метанол, основано на конкуренции за активный центр фермента печени алкогольдегидрогеназы. Этот фермент преобразует метанол в формальдегид, повреждающий различные ткани организма. Обычным исходом попадания в организм метанола является слепота, поскольку глаза особенно чувствительны к формальдегиду. Этанол — альтернативный субстрат алкогольдегидрогеназы. Действие этанола напоминает действие конкурентного ингибитора, с тем отличием, что он также является субстратом, и его концентрация снижается по мере превращения в ацетальдегид. Лечение при отравлении метанолом состоит в медленном внутривенном введении этанола с такой скоростью, которая позволяет поддерживать постоянной его концентрацию в крови на протяжении нескольких часов. В результате количество образующегося формальдегида уменьшается; в это время метанол фильтруется почками и выводится с мочой, не нанося вреда организму. ■

Два других типа обратимого ингибирования — бесконкурентное и смешанное — часто описывают в терминах односубстратной ферментативной кинетики, по в реальности они встречаются только для ферментов, имеющих несколько субстратов. Бесконкурентный ингибитор (рис. 6-15, б) связывается вне активного центра фермента, и, в отличие от конкурентного ингибитора, только с комплексом ЕS. В присутствии бесконкурентного ингибитора уравнение Михаэлиса-Ментен принимает следующий вид:

(6-29)

где

В соответствии с уравнением 6-29 при высоких концентрациях субстрата v₀ приближается к Vm_ах/α'. Таким образом, бесконкурентный ингибитор снижает измеряемое значение Vm_ах. Кажущаяся константа Михаэлиса также снижается, поскольку [S], требуемая для достижения 1/2 снижается в α' раз.

Ингибитор, действующий по механизму смешанного типа (рис. 6-15, в), также связывается вне активного центра, но как с Е, так и с ЕS. Уравнение скорости для случая смешанного ингибирования имеет вид

(6-30)

Смешанный тип ингибирования обычно изменяет как К_м, так и Vm_ах. Особый случай ингибирования смешанного типа, возникающий при α = α’ и редко наблюдающийся на практике, называют неконкурентным ингибированием. Анализируя уравнение 6-30, можно понять, что неконкурентный ингибитор изменяет значение Vm_ах, но не влияет на К_м.

Уравнение 6-30 в общем виде отражает влияние обратимых ингибиторов: его упрощения при α’ = 1,0 или α = 1,0 приводят соответственно к уравнениям для конкурентного и бесконкурентного ингибирования. На основании этого уравнения мы можем сделать общие выводы относительно влияния ингибиторов на отдельные кинетические параметры. Для всех обратимых ингибиторов кажущееся значение V_{mах. каж} = V_mах/α', поскольку при достаточно высоких концентрациях субстрата правая сторона уравнения 6-30 всегда упрощается до V_mах/α'. Для конкурентных ингибиторов α' = 1,0 и, следовательно, не принимается во внимание. Используя это выражение для V_{mах. каж}, можно получить общее выражение для кажущейся константы Михаэлиса и показать, как этот параметр изменяется в присутствии обратимых ингибиторов. Кажущаяся константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой v₀ = 1/2 V_{mах, каж.} иначе говоря, v₀ = V_mах/2α'. Это условие выполняется при [S] = α К_м/α'. Таким образом, К_{м, каж} = α К_м/α'. Как видно из табл. 6-9, это выражение упрощается, если а или а равны единице (т. е. для бесконкурентного или конкурентного ингибитора).

Таблица 6-9 Влияние обратимых ингибиторов на V_{max каж} и K_M.каж

Тип ингирования	V_{mах. каж}	K_{M. каж}
Нет	V_mах	К_м
Конкурентный	V_mах	αК_м
Бесконкурентный	V_max/α'	К_м/α'
Смешанный	V_mах/α'	α'К_м/ α'

На практике бесконкурентное и сметанное ингибирование наблюдается только для ферментов с несколькими субстратами (скажем, S₁ и S₂) и широко применяется для экспериментального изучения таких ферментов. Если ингибитор связывается с центром, который обычно занят субстратом 1, то в экспериментах с изменением концентрации S₁ он может вести себя как конкурентный ингибитор. Если ингибитор связывается с центром, который обычно занят субстратом 2, то он может выступать в качестве бесконкурентного ингибитора или ингибитора смешанного типа по отношению к S₁. Наблюдаемый на практике характер ингибирования зависит от того, является связывание S₁и S₂ упорядоченным или случайным; по экспериментальным данным можно судить о порядке присоединения субстратов и отделения продуктов. Часто дополнительную информацию можно получить, когда один из продуктов реакции выступает в качестве ингибитора. Если в реакционной среде присутствует только один из двух продуктов реакции, то обратная реакция происходить не может. Однако продукт обычно связывается с участком активного центра и действует в качестве ингибитора. Для изучения механизма двухсубстратной ферментативной реакции используют кинетические методы анализа с применением различных комбинаций продуктов и ингибиторов.

Пример 6-3. Влияние ингибитора на константу Михаэлиса

Исследователи, изучавшие веселазу (см. примеры 6-1 и 6-2), выяснили, что ее мощным конкурентным ингибитором является вещество СТРЕСС. Добавление 1 нМ стрессповышает измеряемое значение К_м для субстрата грусть в два раза. Определите значения α и α' в этих условиях.

Решение. Вспомните, что кажущееся значение К_м (значение К_м, измеряемое в присутствии конкурентного ингибитора) соответствует α К_м. Поскольку К_м для ГРУСТЬ увеличивается вдвое в присутствии 1 нМ СТРЕСС, значение α должно быть равно двум. Значение α' для конкурентного ингибитора по определению составляет единицу.

Необратимое ингибирование.

К необратимым ингибиторам относятся те, которые образуют ковалентную связь с ферментом или выводят из строя его функциональные группы, необходимые для катализа, а также те, которые способны образовывать особенно устойчивые нековалентные комплексы с ферментом. Образование ковалентной связи между необратимым ингибитором и ферментом — это довольно распространенное явление. Необратимые ингибиторы служат полезными инструментами для изучения механизмов реакции. Если ингибитор образует ковалентную связь с определенными остатками фермента, в результате чего происходит его инактивация, то идентификация этих остатков помогает определить ключевые аминокислоты, задействованные в катализе (рис. 6-16).

Рис. 6-16. Необратимое ингибирование. Взаимодействие химотрипсина с диизопропилфторфосфатом (ДФФ) приводит к необратимому ингибированию фермента. На этом основании был сделан вывод, что ключевым остатком серина в активном центре химотрипсина является Ser¹⁹⁵.

Особым случаем необратимого ингибирования является так называемое суицидное ингибирование. До тех пор, пока ингибитор такого рода не связался в активном центре фермента, он обладает сравнительно низкой реакционной способностью. Суицидный ингибитор претерпевает несколько обычных стадий ферментативною превращения, но вместо того, чтобы превратиться в нормальный продукт, он превращается в соединение с очень высокой реакционной способностью, которое необратимо связывается с ферментом. Подобные соединения иногда называют субстратоподобными ингибиторами, поскольку они инактивируют фермент, используя его собственный нормальный механизм действия. Такие ингибиторы играют важную роль в современном подходе к направленному поиску лекарственных препаратов, в котором синтез новых фармакологических средств осуществляется на основе знания механизмов реакций. Правильно сконструированный суицидный ингибитор специфичен лишь для одного фермента и нс вступает в реакцию, пока не свяжется с активным центром фермента. Поэтому лекарства, созданные на основании данного подхода, оказывают заметно меньше побочных эффектов (см. доп. 22-3). Несколько примеров необратимых ингибиторов, важных для медицины, приведены в конце разд. 6.4.

Зависимость ферментативной активности от pH

Ферменты характеризуются оптимальным значением или диапазоном значений pH, при котором их активность максимальна (рис. 6-17); при отклонении значений pH в большую или меньшую сторону активность фермента снижается. Ничего удивительного в этом явлении нет. Боковые цепи аминокислотных остатков в активном центре фермента могут проявлять свойства слабых кислот или оснований, функционирование которых зависит от их состояния ионизации. Кроме того, ионизованные боковые цени во всей молекуле фермента могут принимать активное участие в поддержании структуры белка. Например, удаление протона от остатка гистидина может разрушить ионное взаимодействие, важное для стабилизации активной конформации фермента. Менее распространенной причиной чувствительности ферментативной реакции к изменениям pH является реакция нейтрализации (титрование) группы в составе молекулы субстрата.

Рис. 6-17. Зависимость активности двух ферментов от pH. Данные кривые построены на основании измерения начальных скоростей реакции в буферах с различными значениями pH. Поскольку pH — это логарифмическая величина, единица которой отражает десятикратное изменение концентрации протонов, то значения v₀ также откладывали на логарифмической шкале. Оптимальное значение pH для активности фермента обычно лежит в том диапазоне pH, в котором фермент функционирует в физиологических условиях, а) Пепсин, расщепляющий определенные пептидные связи в белках в процессе пищеварения в желудке, имеет pH оптимум активности около 1,6. Значение pH желудочного сока колеблется между 1 и 2. б) Глюкозо-6-фосфатаза гепатоцитов (клеток печени) имеет рН-оптимум около 7,8; этот фермент отвечает за поступление в кровь глюкозы. Нормальный pH в цитозоле гепатоцитов составляет примерно 7,2.

Диапазон pH, в котором происходит изменение активности фермента, может указывать на тип аминокислотных остатков, участвующих в катализе (табл. 3-1). Например, изменение активности фермента в области pH 7,0 может говорить о нейтрализации (титровании) остатка His. Однако интерпретировать влияние pH следует с осторожностью. Внутри молекулы белка значение рКа аминокислотного остатка может быть сильно изменено. Например, локализованный поблизости положительный заряд может снизить рКа остатка Lys, а отрицательный заряд может повысить его значение рКа. Подобные эффекты часто приводят к тому, что значение рКа сдвигается на несколько единиц pH по отношению к значению для свободной аминокислоты. Например, рК, одного остатка Lys в ацетоацстатдекарбоксилазе составляет 6,6 (в свободном лизине — 10,5), что связано с электростатическим влиянием расположенных поблизости положительных зарядов.

Краткое содержание раздела 6.3 Ферментативная кинетика как подход к пониманию механизма действия ферментов

■ Большинство ферментов характеризуются общим набором кинетических параметров. При добавлении субстрата к ферменту происходит быстрая реакция, и достигается стационарное состояние, при котором скорости образования и распада промежуточного комплекса ES равны. При увеличении концентрации субстрата и постоянной концентрации фермента активность фермента возрастает по гиперболической функции и приближается к максимальному значению V_maх, при котором практически весь фермент находится в комплексе с субстратом.

■ Концентрация субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости реакции, называется константой Михаэлиса (К_м), которая характеризует данный фермент по отношению к данному субстрату. Уравнение Михаэлиса-Ментен

связывает начальную скорость реакции с [S] и Vm_ах через константу Михаэлиса. Кинетику Михаэлиса-Ментен иначе называют стационарной кинетикой.

■ Разные ферменты характеризуются различными значениями К_м и Vm_ах. Скорость лимитирующей стадии ферментативной реакции при насыщении описывается константой rcat, называемой числом оборотов. Отношение rcat/К_м является удобной мерой каталитической эффективности фермента. Уравнение Михаэлиса-Ментен также применимо к двухсубстратным реакциям, протекающим через образование тройного комплекса или по механизму «пинг-понг» (двойного замещения).

■ Обратимое ингибирование фермента может иметь конкурентный, бесконкурентный или смешанный механизм. Конкурентные ингибиторы конкурируют с субстратом за связывание в активном центре фермента, но не подвергаются дальнейшим превращениям. Бесконкурентные ингибиторы связываются только с комплексом ЕS, причем связывание происходит вне активного центра фермента. При смешанном характере ингибирования ингибитор связывается как с Е, так и с ЕS, опять же вне активного центра. При необратимом ингибировании ингибитор связывается с активным центром фермента путем образования ковалентных или очень прочных нековалентных связей.

■ Каждый фермент характеризуется оптимальным значением или диапазоном pH, при котором его активность максимальна.