ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

7. УГЛЕВОДЫ И ГЛИКОБИОЛОГИЯ

7.4. Углеводы как информационные молекулы: код сахаров

Гликобиология изучает структуру и функции гликоконъюгатов; сегодня эта наука является одной из наиболее активно развивающихся и удивительных областей биохимии и клеточной биологии. Уже понятно, что клетки используют специфические олигосахариды для кодирования важной информации, касающейся внутриклеточного транспорта белков, межклеточных взаимодействий, развития тканей и передачи внеклеточных сигналов. Мы обратимся лишь к нескольким примерам, иллюстрирующим разнообразие структуры и диапазон биологической активности гликоконъюгатов. В гл. 20 мы обсудим детали биосинтеза полисахаридов, в том числе пептидогликанов, а в гл. 27 — механизмы сборки олигосахаридных цепей в гликопротеинах.

Совершенствование методов анализа структуры олигосахаридов и полисахаридов позволило выявить удивительную сложность и разнообразие олигосахаридных цепей в гликопротеинах и гликолипидах. Взгляните на типичные олигосахариды гликопротеинов, изображенные на рис. 7-29. Наиболее сложный из них содержит 14 моносахаридных остатков четырех видов, связанных между собой связями 1 —> 2, 1 —> 3, 1 —> 4, 1 —> 6, 2 —> 3 и 2 —> 6, некоторые из связей имеют α-, а другие — β-конфигурацию. В олигосахаридах довольно распространены разветвленные структуры, не встречающиеся в нуклеиновых кислотах и белках. Если предположить, что для образования олигосахарида может быть использовано 20 различных моносахаридных звеньев (что вполне возможно), то расчетное число гесксамерных олигосахаридов составит 1,44 • 10¹⁵. В то же время количество гексапептидов, построенных из 20 аминокислот, составляет 6,4 • 10⁷ (20⁶), а количество гексануклеотидов, построенных из четырех нуклеотидных звеньев, составляет 4096 (4⁶). Если, кроме того, учесть возможность сульфатирования остатков сахаров, то полученная цифра вырастет еще на два порядка. Олигосахариды необычайно богаты структурной информацией; ее объем не только сравним, но намного превосходит объем информации, содержащейся в молекуле нуклеиновой кислоты среднего размера. Каждый из олигосахаридов, изображенных на рис. 7-29, характеризуется уникальной пространственной структурой «сахарным кодом», который умеют расшифровывать взаимодействующие с ними белки.

Лектины — белки, «читающие» код сахаров и участвующие во многих биологических процессах

Лектины, обнаруженные во всех организмах, представляют собой белки, которые с чрезвычайно высоким сродством и специфичностью связываются с определенными углеводами (табл. 7-3). Лектины принимают участие во многих процессах узнавания, передачи сигнала и адгезии клеток, а также во внутриклеточном транспорте вновь синтезированных белков. В лаборатории, очищенные лектины используют для обнаружения и разделения гликопротеинов с различными олигосахаридными цепями. Здесь мы остановимся лишь на нескольких примерах, иллюстрирующих значение лектинов в животной клетке.

Таблица 7-3. Некоторые лектины и их олигосахаридные лиганды

Некоторые циркулирующие в крови пептидные гормоны содержат остатки сахаров, определяющие время их жизни. Лютеинизирующий и тиреотропный гормоны (полипептидные гормоны коры надпочечников) содержат присоединенные N-гликозидной связью олигосахариды, имеющие на конце дисахарид GаlNАс4S (β1—> 4) GlсNАс, который узнается лектином (рецептором) гепатоцитов (GаlNАс4S это N-ацетилгалактозамин, сульфатированный по ОН-группе атома С-4). Взаимодействие рецептора с гормоном регулирует захват и разрушение лютеинизирующего и тиреотропного гормонов и, следовательно, их концентрацию в крови. Таким образом, уровень этих гормонов в крови то повышается в результате секреции надпочечниками, то падает в результате постоянного разрушения в гепатоцитах.

Остатки сиаловой кислоты (Nеu5Ас), расположенные на концах олигосахаридных цепей многих гликопротеинов плазмы крови (рис. 7-29), защищают эти белки от разрушения в печени. Например, медьсодержащий сывороточный гликопротеин церулоплазмин имеет несколько олигосахаридных цепей с Nеu5Ас на конце. Удаление остатков сиаловой кислоты ферментом сиалидазой (другое название нейраминидаза) используется клеткой для мечения «старых» белков, которые необходимо уничтожить и заменить другими. Плазматическая мембрана гепатоцитов содержит молекулы лектинов, называемых рецепторами асиалогликопротеинов (т. е. десиалированных гликопротеинов). Эти рецепторы способны специфическим образом связывать олигосахаридные цепи, в которых остатки галактозы больше не защищены концевым остатком Nеu5Ас. Взаимодействие рецептора с церулоплазмином приводит к эндоцитозу и уничтожению церулоплазмина.

По всей видимости, похожий механизм применяется в организме млекопитающих для удаления из кровотока старых эритроцитов. Молодые эритроциты несут на себе несколько мембранных гликопротеинов с олигосахаридными цепями, заканчивающимися Neu5Ac. Если в эксперименте in vitro удалить остатки сиаловой кислоты из образца крови с помощью сиалидазы, а затем возвратить эту кровь в циркуляцию, то подвергшиеся такой процедуре эритроциты исчезают за несколько часов. Эритроциты с интактными олигосахаридными цепями (те, что были отобраны и возвращены в кровоток без обработки сиалидазой) циркулируют в организме еще несколько дней.

Лектины клеточной поверхности играют важную роль в развитии некоторых заболеваний человека, причем это относится как к лектинам человека, так и к лектинам инфицирующего агента. Селектинами называют лектины плазматической мембраны, обеспечивающие узнавание и адгезию клеток в широком спектре клеточных процессов. Одним из таких процессов является перемещение клеток иммунной системы (нейтрофилов) из крови через стенку капилляра к воспаленным или инфицированным участкам тканей (рис. 7-31). В инфицированном участке Р-селектин, расположенный на поверхности эндотелиальной клетки капилляра, взаимодействует с определенным олигосахаридом гликопротеина циркулирующего нейтрофила. Это взаимодействие замедляет движение нейтрофила и заставляет его «перекатываться» по эндотелию капилляра. Далее происходит взаимодействие между молекулами интегрина (с. 641) на плазматической мембране нейтрофила и адгезионным белком на поверхности эндотелия. Это взаимодействие окончательно останавливает передвижение нейтрофила и позволяет ему проникнуть сквозь стенку капилляра к инфицированной ткани, чтобы начать иммунную атаку. В описанном процессе (так называемом хоуминге лимфоцитов) участвуют еще два типа селектинов: Е-сслектины па эндотелиальных клетках и Е-селектины на нейтрофилах связывают определенные олигосахариды соответственно на нейтрофилах и клетках эндотелия.

Рис. 7-31. Взаимодействия лектинов с лигандами при миграции лимфоцитов к местам воспаления или повреждения. Движение нейтрофила в капилляре замедляется в результате краткосрочных взаимодействий между молекулами Р-селектина на плазматических мембранах эпителиальных клеток капилляра и лигандами Р-селектина на поверхности нейтрофила. По мере взаимодействия нейтрофила с расположенными на поверхности эпителия молекулами Р-селектина его «перекатывание» по стенке капилляра замедляется. В области воспаления более сильное взаимодействие между интегринами на поверхности капилляра и их лигандами на нейтрофиле полностью тормозит движение нейтрофила. Под влиянием сигналов от места воспаления происходит экстравазация — нейтрофил проходит сквозь стенку капилляра к месту воспаления.

Селектины человека участвуют в формировании воспалительного процесса при ревматоидном артрите, астме, псориазе, рассеянном склерозе и отторжении трансплантированных органов. С этим связана острая необходимость создания лекарств, ингибирующих адгезию клеток, опосредованную селектинами. Многие клетки карциномы экспрессируют антиген, который в норме присутствует только на клетках плода (сиалил-Льюис х, или сиалил-Lex), а при попадании в циркулирующую кровь способствует распространению раковых клеток и метастазированию. Углеводные производные, имитирующие сиалил-Lex в составе сиалогликопротеинов, а также те, что изменяют путь биосинтеза олигосахаридов, могут оказаться эффективными лекарственными препаратами для лечения хронических воспалительных заболеваний или для борьбы с метастазами при раке.

Некоторые вирусы животных, в том числе вирус гриппа, прикрепляются к клеткам хозяина с помощью олигосахаридов, находящихся на поверхности клеток. Лектин вируса гриппа, известный как белок НА (гемагглютенин), играет важную роль в проникновении вируса и развитии инфекции. После того как вирус проник в клетку хозяина и реплицировался, новосинтезированные вирусные частицы выходят из клетки, обернутые кусочками ее плазматической мембраной. Вирусная сиалидаза (нейраминидаза) удаляет концевой остаток сиаловой кислоты с олигосахаридов на поверхности клетки хозяина, освобождая вирусные частицы от клетки и препятствуя их слипанию друг с другом. После этого начинается новая стадия заражения. Для лечения гриппа применяют противовирусные препараты осельтамивир (тамифлю) и занамивир (реленза). Эти лекарства — производные сахаров; они ингибируют вирусную сиалидазу, конкурируя за связывание с олигосахаридами клетки хозяина. Это предотвращает высвобождение вирусов из зараженной клетки и заставляет вирусные частицы слипаться, таким образом блокируя следующую стадию инфекции.

Первой стадией инфекционного цикла вирусов простого герпеса HSV-1 и HSV-2 (возбудители герпеса ротовой полости и гениталий соответственно) является специфическое связывание их лектинов с гепарансульфатом на поверхности клеток хозяина, причем для развития инфекции необходим правильный порядок расположения сульфатных групп в этом полимере.

С помощью лектинов некоторые патогенные микробы прикрепляются к клеткам хозяина или вводят в них свой токсин. Причиной развития большинства случаев язвенной болезни желудка, как показали в 1980-х гг. Барри Дж. Маршалл и Дж. Робин Уоррен, является бактерия Helicobacter pylori, которая прикрепляется к внутренней стенке желудка путем взаимодействия между лектинами на бактериальной оболочке и специфическими олигосахаридами в мембранных гликопротеинах эпителия желудка (рис. 7-32). Одним из участков узнавания Н. pylori служит олигосахарид Le^b — фрагмент детерминанты группы крови 0. Этот факт помогает объяснить, почему язва желудка в несколько раз чаще возникает у людей с группой крови 0, чем у людей с группами крови А или В. Для лечения данных заболеваний могут оказаться полезными аналоги Le^b, синтезированные химическим путем. Конкурируя с гликопротеинами желудка за связывание с бактериальными лектинами, они способны предотвратить адгезию бактерии и, следовательно, развитие инфекции.

Рис. 7-32. Образование язвы желудка. Клетки Helicobacter pylori, прикрепившиеся к стенке желудка. Язва возникает в результате взаимодействия бактериального лектина и олигосахарида Le^b (антигена группы крови 0) на поверхности эпителия желудка.

Некоторые наиболее тяжелые паразитарные инфекционные заболевания человека, распространенные в основном в развивающихся странах, вызываются эукариотическими микроорганизмами, имеющими на своей поверхности необычные олигосахариды, которые в некоторых случаях исполняют в клетках паразитов защитную функцию. Среди этих организмов можно назвать трипаносомы, ответственные за африканскую сонную болезнь и болезнь Шагаса, Plasmodium falciparum, вызывающую малярию, и Entamoebahistolytica, являющуюся причиной возникновения амебной дизентерии. В связи с поиском лекарств, останавливающих синтез этих необычных олигосахаридных цепей и репликацию паразитов, был предпринят целый ряд исследований, посвященных путям биосинтеза этих олигосахаридов.

Холерный токсин, вырабатываемый Vibrio cholerae, проникает в клетки кишечника, отвечающие за всасывание воды, и вызывает диарею. Токсин связывается с клетками-мишенями через олигосахарид ганглиозида GM1 — мембранного фосфолипида на поверхности кишечного эпителия (структура GM1 изображена в доп. 10-2,

рис. 1). Аналогичным образом токсин, вырабатываемый возбудителем коклюша Bordetella pertussis, проникает в клетки-мишени только после взаимодействия с одним или, возможно, несколькими олигосахаридами, имеющими на конце цепи остаток сиаловой кислоты. Знание точной структуры участков связывания олигосахаридов в этих токсинах (лектинах) может помочь в создании генно-инженерных аналогов токсинов для вакцинации. Генно-инженерные аналоги токсинов, не имеющие участка связывания углеводов, безопасны для человека, поскольку не могут связываться с клеткой и проникать внутрь, но могут вызывать иммунный ответ, который предохранил бы человека от последующего воздействия природного токсина. Возможно также представить себе лекарство, которое имитирует олигосахариды клеточной поверхности, связывается с бактериальными лектинами и предотвращает их продуктивное связывание с поверхностью клетки.

Лектины проявляют свою активность и внутри клетки. В аппарате Гольджи олигосахарид, содержащий маннозо-6-фосфат, метит вновь синтезированные белки, которые предназначены для транспортировки в лизосомы (рис. 27-39). Общая структурная черта этих гликопротеинов — своеобразный сигнальный участок — обеспечивает их узнавание ферментом, фосфорилирующим остаток маннозы на конце олигосахаридной цепи. Образующийся в результате остаток маннозо-6-фосфата узнается катион-зависимым маннозофосфатным рецептором, представляющим собой мембраносвязанный лектин, который имеет центр связывания маннозофосфата на люменальной поверхности аппарата Гольджи. Когда участок аппарата Гольджи, содержащий этот рецептор, отпочковывается, образуя транспортную везикулу, белки с маннозофосфатными остатками затягиваются в формирующуюся везикулу в результате взаимодействия между маннозо-6-фосфатом и его рецептором. Затем везикулы сливаются с лизосомами и высвобождают свое содержимое. Многие, если не все, гидролитические ферменты лизосом захватываются и переносятся именно по такому механизму. Некоторые рецепторы маннозо-6- фосфата могут захватывать ферменты, содержащие остатки маннозо-6-фосфата, и направлять их в лизосомы. Этот процесс лежит в основе «заместительной ферментативной терапии», целью которой является коррекция нарушений, связанных с активностью лизосом у человека. ■  Кроме того, лектины участвуют в других процессах, связанных с сортировкой белков. Любой вновь синтезированный белок в эндоплазматическом ретикулуме уже связан с определенным олигосахаридом, который может быть присоединен с помощью одного из двух лектинов ЭР (одновременно являющихся шаперонами): мембраносвязанного кальнексина и находящегося в растворе кальретикулина. Эти лектины связывают новый белок с ферментом, который осуществляет быстрый дисульфидный обмен в процессе укладки белка, в конечном итоге приводящий к образованию нативной конформации. В этот момент ферменты в ЭР обрабатывают олигосахаридные остатки таким образом, чтобы они узнавались другим лектином, ЕRGIC53, который направляет сформированный белок (гликопротеин) в аппарат Гольджи для дальнейшего созревания. Если белок упакован неверно, олигосахариды обрабатываются иным образом и узнаются лектином ЕDЕМ, который направляет аномально упакованный белок в цитозоль, где тот уничтожается. Таким образом, гликозилирование белков в ЭР служит определенным сигналом, позволяющим клетке элиминировать неправильно сформированные белки (более подробно этот процесс обсуждается в гл. 27).

Взаимодействие лектина с углеводом очень прочное и высокоспецифичное

Во всех описанных выше функциях лектинов и во многих других, связанных со взаимодействиями между лектинами и олигосахаридами, важна уникальная структура олигосахарида, обеспечивающая высокую специфичность взаимодействия. Информация, содержащаяся в олигосахаридах, выражается в виде своеобразного кода с практически бесконечным набором коротких «слов», распознаваемых отдельными белками. Центры связывания олигосахаридов в молекулах лектинов комплементарны строго определенным углеводным последовательностям, в результате чего взаимодействие лектинов с олигосахаридами отличается чрезвычайно высокой специфичностью. Сродство олигосахарида к каждому углевод- связывающему домену лектина часто невелико (значения К_d находятся в микромолярном диапазоне), однако эффективное сродство многократно усиливается за счет мультивалентности лектинов, поскольку каждая молекула лектина имеет множество углевод-связывающих доменов. В кластерах олигосахаридов (которые обычно образуются на поверхности мембраны), например, каждый олигосахарид может связаться с одним из углевод- связывающих доменов лектина, усиливая взаимодействие. Если па поверхности клетки существует множество рецепторов, авидность взаимодействия может быть очень высокой и обеспечивать такие высококооперативные процессы, как прикрепление и перекатывание клеток (см. рис. 7-31).

Рентгеноструктурный анализ некоторых комплексов лектинов с углеводами позволил в деталях изучить особенности этих взаимодействий (рис. 7-33). Семейство из 11 лектинов, которые связывают олигосахаридные цепи, оканчивающиеся на остаток сиаловой кислоты, выполняет в организме человека несколько важных биологических функций. Все эти лектины связывают сиаловыс кислоты в доменах со структурой ß-сэндвича, подобных тем, что обнаружены в иммуноглобулинах (этот мотив изображен в белке CD8 на рис. 4-21). Все члены семейства носят название siglec (sialic acid-recognizing Ig- superfamily lectins) и имеют номера от 1 до 11; иногда иначе их называют сиалоадгезинами. Во взаимодействии siglec с сиаловой кислотой (N-ацетилнейраминовой кислотой, Neu5Ac) участвуют все заместители в кольце Neu5Ac: ацетогруппа у атома С-5 участвует в образовании водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействиях с белком, карбоксильная группа образует солевой мостик с консервативным остатком Arg, а гидроксильные группы остатка глицерина — водородные связи с белком. Лектины siglecs регулируют процессы в иммунной и нервной системе, а также участвуют в развитии клеток крови. Например, siglec-7 связывается со специфическим ганглиозидом (GD3), содержащим два остатка сиаловой кислоты, и подавляет активность естественных клеток-киллеров (NK-клеток), оберегая тем самым клетки, которые должны уничтожаться иммунной системой. Повышение уровня GD3 при некоторых раковых заболеваниях, таких как злокачественная меланома и нейробластома, возможно, позволяет раковым клеткам преодолеть защитный механизм иммунной системы.

Рис. 7-33. Подробности взаимодействия лектина с углеводом, а) Рецептор маннозо-6- фосфата быка с маннозо-6-фосфатом (PDB ID 1М6Р) на поверхности; цветом обозначено распределение электрического заряда: красные области преимущественно заряжены отрицательно, синие — преимущественно положительно. Молекула маннозо-6-фосфата изображена в виде стержневой структуры; ион марганца выделен фиолетовым цветом, б) Центр связывания в увеличенном виде. Маннозо-6-фосфат образует водородную связь с остатком Arg¹¹¹и координационную связь с ионом Мn²⁺ (для ясности показан меньшего размера, чем ван-дер-ваальсовый радиус). Остаток His¹⁰⁵ образует водородную связь с одним из атомов кислорода в фосфатной группе. Возможно, протонирование этого остатка при более низком значении pH в лизосоме приводит к высвобождению маннозо-6-фосфата рецептором.

Структура другого лектина — рецептора маннозо-6-фосфата — тоже была определена методом РСА. Удалось выяснить детали взаимодействия этого лектина с маннозо-6-фосфатом, объяснить специфичность связывания и необходимость участия в этом взаимодействии двухвалентного катиона (рис. 7-33, а). Остаток Arg¹¹¹ в молекуле рецептора образует водородную связь с гидроксильной группой у атома С-2 в остатке маннозы, координированном с помощью иона Мn²¹. Остаток His¹⁰⁵ образует водородную связь с одним из атомов кислорода в фосфатной группе (рис. 7-33, б). При попадании белка, связанного с маннозо-6- фосфатом, в л изосому, где значение pH ниже, чем в аппарате Гольджи, сродство рецептора к маннозо- 6-фосфату снижается. Причиной этого, возможно, является протонирование остатка His¹⁰⁵.

Кроме названных специфических взаимодействий существуют и более общие взаимодействия, которые также вносят вклад в связывание многих углеводов с соответствующими лектинами. Например, многие остатки сахаров имеют более полярную и менее полярную стороны (рис. 7-34). Более полярные участки образуют водородные связи с лектином, а менее полярные участвуют в гидрофобных взаимодействиях с неполярными аминокислотными остатками белка. Результатом всех этих взаимодействий становится высокое сродство (часто К_d ≤10^-8 М) и высокая специфичность связывания. В этом состоит один из возможных способов передачи информации, который оказывается ключевым во многих внутриклеточных процессах и взаимодействиях между клетками. На рис. 7-35 представлены некоторые биологические процессы, в которых сахара выступают как носители информации.

Рис. 7-34. Гидрофобные взаимодействия остатков сахаров. Мономерные звенья сахаров, таких как галактоза, имеют более полярную сторону (в верхней части кресла, где расположены кислород кольца и гидроксильные группы), участвующую в образовании водородных связей с лектином, и менее полярную сторону, которая может участвовать в гидрофобных взаимодействиях с неполярными аминокислотными остатками, такими как индольное кольцо триптофана.

Рис. 7-35. Участие сахаров в процессах узнавания и адгезии на поверхности клеток. а) Олигосахариды с уникальной структурой (изображены в виде последовательности шестичленных колец), входящие в состав различных гликопротеинов или гликолипидов на внешней поверхности плазматической мембраны, с высоким сродством и специфичностью взаимодействуют с внеклеточными лектинами, б) Инфицирующие клетки животных вирусы, такие как вирус гриппа, на первой стадии инфекционного цикла связываются с гликопротеинами на поверхности клетки, в) Бактериальные токсины (например холеры или коклюша) для проникновения в клетку связываются с гликолипидом на клеточной поверхности, г) Некоторые бактерии (в частности, Helicobacter pylori) прикрепляются к клетке хозяина, а затем колонизируют или инфицируют ее. д) Селектины (лектины) в плазматической мембране некоторых клеток выступают в качестве посредников в межклеточных взаимодействиях, в частности во взаимодействии Т-лимфоцитов с эндотелиальными клетками капилляров в участке воспаления. е) Рецептор маннозо-6-фосфата (маннозосвязывающий лектин) в транс-Гольджи сети связывается с олигосахаридом лизосомального фермента и способствует его переносу в лизосому.

Краткое содержание раздела 7.4 Углеводы как информационные молекулы: код сахаров

■ Моносахариды могут быть организованы в виде почти бесконечного разнообразия сочетаний олигосахаридов, которые различаются по стереохимии и положению гликозидной связи, типу и ориентации заместителей, числу и типу разветвлений. Олигосахариды несут в себе гораздо больше информации, чем молекулы нуклеиновых кислот или белков.

■ Лектины — белки со специфическими углевод-связывающими участками — обычно располагаются на внешней поверхности клетки, где инициируют взаимодействия с другими клетками. Лектины позвоночных по олигосахаридным «ярлыкам» узнают некоторые пептидные гормоны, циркулирующие белки плазмы и клетки крови и регулируют их уничтожение.

■ Прикрепление патогенных вирусов, бактерий и некоторых эукариотических паразитов к клеткам организма-хозяина происходит через связывание лектинов на клетках патогенов с олигосахаридами на поверхности клеток хозяина.

■ Внутриклеточные лектины участвуют в доставке внутриклеточных белков к определенным органеллам или к месту их секреции.

■ Рентгеноструктурный анализ позволил детально изучить комплексы лектинов с сахарами и установить комплементарность этих молекул, объясняющую прочность и специфичность их взаимодействий.