Биохимия человека Том 1 - Марри Р. 1993

Биомолекулы и биохимические методы
Клетка

Шлейден и Шванн, а также другие пионеры науки XIX в., в частности Вирхов, считали клетку фундаментальной единицей биологической активности. Однако сразу же после окончания второй мировой войны произошли три события, ознаменовавшие собой начало периода раздельного развития биохимии и клеточной биологии. Это: 1) широкое распространение электронных микроскопов; 2) разработка методов разрушения клеток в сравнительно мягких условиях, позволяющих сохранить функции их компонентов; 3) широкое распространение высокоскоростных ультрацентрифуг с охлаждением, с помощью которых можно было создавать центробежные силы, достаточные для разделения компонентов разрушенных клеток, и избегать их перегрева. С помощью электронной микроскопии было выявлено множество ранее неизвестных или плохо различимых клеточных компонентов, а разрушение клеток и ультрацентрифугирование позволили разделить их и провести исследование in vitro.

Таблица 2.3. Нормальный химический состав организма человека весом 65 кг¹⁾

¹⁾ Из работы Davidson S. D., Passmore R., Brock J. F.: Human Nutrition and Dietetics, 5th ed. Churchill Livingstone, 1973, с разрешения.

²⁾ Содержание воды в разных тканях существенно различается: в ткани кости, не содержащей костного мозга, на ее долю приходится 22,5%. Содержание воды снижается также при накоплении жира.

Клетка печени крысы

На рис. 2.1 схематически изображена клетка печени крысы (гепатоцит). Биохимические свойства этих клеток изучены наиболее подробно — частично из-за того, что клетки печени удается получать в относительно больших количествах, а частично благодаря тому, что они удобны для фракционирования и выполняют множество функций. Гепатоцит содержит все основные типы органелл, присутствующих в клетках эукариот (табл. 2.4), — ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, свободные рибосомы, аппарат Гольджи, лизосомы, пероксисомы, плазматическую мембрану и элементы цитоскелета.

Рис. 2.1. Схематическое изображение клетки печени крысы, на котором показаны основные клеточные органеллы.

Субклеточное фракционирование

Для глубокого изучения функций любой из органелл необходимо прежде всего получить эти органеллы в относительно чистом виде, так, чтобы их препарат был как можно меньше загрязнен другими органеллами. Процесс, с помощью которого этого обычно удается достичь, называется субклеточным фракционированием и состоит из трех этапов: экстракции, гомогенизации и центрифугирования. Большинство первых работ в этой области выполнено на печени крысы.

А. Экстракция. Первым шагом при выделении специфических органелл (или молекул) является их экстрагирование из клеток, в которых они находятся. Большинство органелл и многие биомолекулы (в частности, белки) весьма лабильны (неустойчивы) и легко утрачивают биологическую активность.

Поэтому их нужно экстрагировать в мягких условиях (в водных растворах, избегая экстремальных значений pH, осмотического давления, а также высоких температур). Большая часть операций по выделению органелл производится при 0—4° С (в холодной комнате или на льду). При комнатной температуре может наблюдаться значительное уменьшение активности, частично вследствие действия различных гидролитических ферментов (протеаз, нуклеаз и т. д.), высвобождающихся при разрушении клеток. Обычно для экстракции органелл используют 0,25 М раствор сахарозы (изоосмотический раствор), содержащий ионы К⁺ и Mg²⁺ в концентрации, близкой к физиологической; pH раствора доведен до 7,4 солянокислым трис-буфером (трис [гидроксиметил]-аминометангидрохлорид) в концентрации 0,05 М. Этот раствор часто называют СТКМ. Не все растворители обеспечивают столь же мягкие условия экстракции, как СТКМ; например, для экстракции липидов и углеводов используют органические растворители.

Б. Гомогенизация. Для выделения органелл (или биомолекул) из клеток необходимо прежде всего разрушить клетки в мягких условиях. Удобным методом разрушения органов (печени, почки, мозга) и составляющих их клеток является гомогенизация. Для этого измельченные фрагменты соответствующего органа помещают в стеклянный стаканчик подходящих размеров, заполненный раствором для гомогенизации (например, СТКМ), а затем пестиком (вручную или с помощью моторчика) приводят смесь во вращение. Вращение пестика с контролируемой скоростью создает силы вязкого трения, под действием которых клетки разрушаются и их содержимое высвобождается в раствор сахарозы. Полученную суспензию, содержащую многие интактные (неповрежденные) органеллы, называют гомогенатом.

В. Центрифугирование. Субфракционированне гомогената путем дифференциального центрифугирования — это один из наиболее важных методов биохимии. В классическом случае используются три стадии центрифугирования при возрастающих скоростях (рис. 2.2). В ходе каждой из них образуются осадок и надосадочная жидкость (супернатант). Супернатант, полученный на каждой из стадий, подвергается центрифугированию на следующей стадии. В результате этой процедуры образуются три типа осадков, которые называют ядерной, митохондриальной и микросомной фракциями. Ни одна из этих фракций не представляет собой абсолютно чистые органеллы. Однако с помощью электронного микроскопа, а также путем идентификации соответствующих «маркерных» ферментов и химических компонентов (например, ДНК или РНК) было установлено, что главными компонентами этих трех фракций являются ядра, митохондрии и микросомы соответственно. «Маркерный» фермент или химическое соединение — это тот компонент, который присутствует практически только в составе данного типа органелл; например, кислая фосфатаза находится в лизосомах, а ДНК — в ядре (табл. 2.4). Таким образом, маркер служит индикатором присутствия или отсутствия фракции тех органелл, в составе которых он находится. Микросомная фракция (микросомы) представляет собой в основном смесь фрагментов гладкого эндоплазматического ретикулума, шероховатого эндоплазматического ретикулума (т. е. эндоплазматического ретикулума с присоединенными к нему рибосомами) и свободных рибосом. Содержимое супернатанта, полученного на конечной стадии, приблизительно соответствует составу клеточного сока (цитозоля). Модификации этого основного подхода, основанные на использовании различных сред для гомогенизации, разных условий или методов центрифугирования (например, использование непрерывного или ступенчатого градиента сахарозы), позволили выделить в более или менее чистом виде все органеллы, показанные на рис. 2-1й перечисленные в табл. 2.4. Описанная выше схема применима к большинству органов и клеток, однако в каждом случае для стандартизации процедуры субклеточного фракционирования необходимо провести серию анализов на содержание маркерных ферментов или других химических компонентов, а также выполнить электронно-микроскопические наблюдения.

Таблиця 2.4. Основные клеточные органеллы и их функции. Перечислены только главные функции каждого типа органелл. В раде случаев в этих органеллах могут протекать и другие процессы и реакции, функционировать другие метаболические пути

¹⁾ Органеллу можно определить как ограниченную мембраной субклеточную структуру, которую можно выделить при высокоскоростном центрифугировании. Согласно этому определению, рибосомы, цитоскелет и цитозоль не являются органеллами. Однако в этой таблице они перечислены вместе с органеллами, поскольку их тоже обычно выделяют путем центрифугирования. Их можно рассматривать как субклеточные образования или фракции. Препарат органелл, выделенных в ходе одного цикла дифференциального центрифугирования, редко бывает чистым; чтобы получить чистую фракцию, обычно приходится центрифугировать препарат по меньшей мере несколько раз.

²⁾ Фракция цитоскелета идентифицируется с помощью электронной микроскопии или путем электрофоретического анализа на содержание специфичных для этой фракции белков.

Рас. 2.2. Схема разделения субклеточных фракций с помощью дифференциального центрифугирования. Гомогенизированную ткань (например, печень) сначала центрифугируют при малой скорости, что приводит к осаждению ядерной фракции (содержащей ядро и неразрушенные клетки) и отделению супернатанта (1). Супернатант осторожно сливают (декантируют) и проводят центрифугирование при более высокой скорости, в результате чего разделяются митохондриальная фракция (содержащая митохондрии, лизосомы и пероксисомы) и супернатайт (2). Последний декантируют и центрифугируют при высокой скорости, в результате чего формируется микросомная фракция (содержащая смесь свободных рибосом и фрагментов гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума) и отделяется чистый прозрачный раствор — конечный супернатант (3). Последний представляет собой цитозоль, или клеточный сок. Используя различные модификации представленного здесь подхода, обычно выделяют каждую из клеточных органелл в относительно чистом виде.

Значение субклеточного фракционирования для развития биохимии и клеточной биологии невозможно переоценить. Оно составляет одно из главных звеньев общего экспериментального подхода (см. ниже), с помощью которого удалось выяснить функции органелл, перечисленные в табл. 2.4. Получение этой информации представляет одно из главных достижений биохимических исследовании (см. ниже).