Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 2 - Д. Мецлер 1980

Ферменты: белковые катализаторы клеток
Основы ферментативной кинетики
Кинетика быстрых реакций

Обычные методы исследования стационарной кинетики не позволяют наблюдать за самыми быстрыми стадиями ферментативного процесса — они применимы только в том случае, когда время полупревращения для реакции превышает 10 с. Поэтому для измерения скоростей реакций со временами полупревращения от 10^-13 до 1 с был разработан целый ряд новых методов [10, 28—30]¹⁾.

¹⁾ Можно рекомендовать также сборник Molecular biology, biochemistry and biophysics, V. 24, Chemical relaxation in molecular biology, I. Pecht and R. Rigler (Eds.), Springer-Verlag, Berlin, 1977, и вышедшую не так давно книгу «Методы исследования быстрых реакций», Г. Хеммис (ред.) —М.: Мир, 1977. — Прим. перев.

а. Струевые методы

Один из первых методов изучения кинетики быстрых реакций основывается на быстром смешивании реагентов, осуществляемом слиянием потоков двух растворов в специальном смесителе. Далее смесь пропускают через прямую трубку со скоростью несколько метров в секунду. Если скорость составляет 10 м∙с^-1, то струя проходит 1 см за 10^-13 с. Наблюдать за смесью можно на подходящем расстоянии от места смешивания (например, на расстоянии 1 см) и при различных скоростях струи. Для регистрации образования продукта или расходования субстрата используют спектрофотометрические или другие методы. Достоинством метода является то обстоятельство, что он не требует быстрой регистрации, однако его использование сопряжено с расходом больших количеств дефицитных реагентов и прежде всего очищенных ферментов.

Широко применяемый метод остановленной струи основан на быстром смешивании двух растворов за интервал времени, составляющий всего 1—2 мс (или даже меньше). Струю создают и останавливают посредством плунжера, который приводит в движение два медицинских, шприца. Оба раствора поступают в смеситель и далее в кювету, где после остановки струи измеряются поглощение света, э. д. с., электропроводность и т. д. Метод требует быстрой регистрации. Если, например, измеряется поглощение света, то используют фотоумножитель, подсоединенный к осциллографу. Изменения поглощения, происходящие за доли секунды, регистрируют на экране осциллографа и полученный «след» кривой фотографируют. Таким путем можно измерить времена релаксации до нескольких миллисекунд.

б. Релаксационные методы

Кинетические измерения в интервалах времени, составляющих десятки микросекунд и менее, проводят с помощью кратковременного возмущения системы, приводящего к небольшому смещению положения, равновесия реакции (или серии реакций), и дальнейшего наблюдения за скоростью достижения нового равновесия (т. е. за процессом релаксации). Наиболее широко применяется метод температурного скачка, предложенный Эйгеном (Eigen) и его сотрудниками. Между Электродами, помещенными в исследуемый раствор, за ∼10^-6 с создают разность, потенциалов —100 кВ. Быстрый электрический разряд от группы конденсаторов, проходя через раствор (и не приводя при этом к образованию искр), повышает его температуру на 2—10°. Равновесие всех химических реакций, для которых ∆Н ≠ 0, смещается. Измеряя какой-либо параметр системы (например, оптическую плотность при определенной длине волны или электропроводность раствора), можно регистрировать очень малые времена релаксации.

Хотя это и не очевидно, но, когда смещение положения равновесия мало, установление нового равновесного состояния всегда можно представить как процесс первого порядка [см., например, уравнение (6-13)].

Если в процессе восстановления равновесия участвует более чем одна химическая реакция, каждой из них соответствует свое характерное время релаксации. Когда эти времена примерно одинаковы, определить их по отдельности довольно трудно, однако, как правило, времена релаксации разных химических реакций различаются на порядок и даже более. Таким образом, для исследуемой системы часто удается измерить два и больше времен релаксации. В отдельных случаях эти времена можно прямо связать с константами скорости отдельных стадий. Например, Эйген наблюдал за скоростью взаимодействия Н⁺ с ОН^-, регистрируя изменение электропроводности воды вслед за температурным скачком [10]. При 23 °С величина т составляла 37∙10^-6 с. Константа скорости процесса

была рассчитана при помощи следующего соотношения:

Скачки давления или напряженности электрического поля могут использоваться в режиме, приводящем к периодическому изменению некоторого параметра системы. Например, поглощение ультразвука вызывает периодическое изменение давления в системе.

в. Импульсный фотолиз (флеш-фотолиз)

Еще один широко используемый метод — это импульсный фотолиз. Световой импульс, возникающий при разрядке конденсатора импульсной лампы, быстро поглощается образцом, находящимся в параллельно расположенной трубке. Длительность импульса может меняться от 10^-12 до 10^-14 с. Сопровождающие вспышку изменения спектра поглощения или флуоресценции образца регистрируются при помощи фотоумножителя и осциллографа. В настоящее время в качестве источников света применяются лазеры, испускающие импульс света исключительно высокой интенсивности в течение нескольких наносекунд. Лазерная техника позволяет измерять весьма малые времена релаксации [31].

г. Некоторые результаты

Описанные выше методы позволили установить, что процессы образования комплексов между ферментами и субстратами протекают исключительно быстро [32] — значения константы k₁ в схеме (6-14) часто лежат в интервале от 10⁶ до 10⁸ М^-1∙с^-1. Тем не менее константа скорости второго порядка для взаимодействия фермента с субстратом ниже предельной величины, соответствующей бимолекулярной реакции, скорость которой лимитируется диффузией (10⁹—10¹⁰ М^-1∙с^-1). Это означает, что молекуле субстрата требуется определенное время на то, чтобы должным образом ориентироваться и связаться с активным центром фермента. Времена релаксации для переходов спираль — клубок в полипептидах составляют около 10^-8 с, для ренатурации же предварительно денатурированных белков они могут быть намного выше. Конформационные превращения производных циклогексана типа «кресло» — «лодка» при комнатной температуре происходят с характерным временем т, равным приблизительно 10^-5 с, а вращение вокруг амидной С—N-связи — с т ≈ 0,1 с, т. е. гораздо медленнее. Для неферментативной гидратации альдегидной группы пиридоксаль-5'-фосфата (гл. 8, разд. Г) т составляет от 0,01 до 0,1 с (в зависимости от pH). Этот результат был получен с помощью метода температурного скачка [33], отличающегося своей надежностью.