Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 2 - Д. Мецлер 1980

Коферменты - особые природные специализированные реагенты
Коферментные формы витамина В12

Исследования по биохимии питания, которые привели в 1948 г. к выделению витамина В1₂(цианкобаламин), внесли мало ясности в вопрос о его коферментиых функциях, и никакой конкретной информации в течение нескольких лет получено не было. Основная трудность заключалась в чрезвычайной чувствительности коферментов к действию света, вызывающему их распад. Успех пришел не там, где его ждали.

Г. А. Баркер обнаружил, что начальной стадией анаэробного сбраживания глутамата у Clostridium tetanomorphum является необычная перегруппировка в ß-метиласпартат [159]:

Последнее соединение может катаболизироваться более или менее обычными путями в ходе реакций, непригодных для катаболизма самого глутамата. Таким образом, эта начальная перегруппировка является обязательной стадией энергетического метаболизма указанного анаэроба.

Необходимый для этой реакции ранее неизвестный кофермент был выделен в 1958 г. после того, как была установлена необходимость защиты его от света в процессе выделения. Структура этого 5'-дезоксиаденозилкофермента В₁₂ (5'-дезоксиаденозилкобаламина) была определена в 1961 г. методом рентгеноструктурного анализа [160].

В₁₂-кофермент превращается в цианкобаламин (дополнение 8-Л) замещением 5'-дезоксиаденозильного остатка на CN-группу, как показывают следующие сокращенные формулы этих соединений [161—166]:

В этих формулах квадратами обозначена циклическая корриновая система, а символом Bz — диметилбензимидазол, координированный с атомом кобальта с нижней стороны корринового цикла.

Наиболее удивительной структурной особенностью является σ-связь-Со—С длиной 2,05 А. Таким образом, кофермент представляет собой алкилкобальт — первое соединение этого типа, обнаруженное в природе. До 1961 г. полагали, что все алкилкобальты неустойчивы. Хотя связь 5'-дезоксикобаламина является ковалентной, угол Со—С—С составляет 130°, что указывает на частично ионный характер связи Со—С [160]. Уровень окисления кобальта равен 3+, и можно представить себе, что цианкобаламин образуется при замещении одного из водородов внутри корринового цикла на Со³⁺ плюс CN^-. Однако следует помнить, что три других цикла азота корринового цикла и азот диметилбензимидазола также образуют связи с кобальтом. Каждый атом азота отдает электронную пару на формирование ковалентных связей хелатного комплекса. В формуле, приведенной в дополнении 8-Л, это показано стрелками, с тем чтобы подчеркнуть формальное различие между этими связями и иной связью Со—N. Однако вследствие резонанса в системе сопряженных двойных связей коррина все четыре связи Со—N цикла примерно равноценны, и положительный заряд делокализован по всем атомам азота, окружающим кобальт.

Как в бактериях, так и в печени 5'-дезоксиаденозильный кофермент является преобладающей формой витамина В₁₂. Однако в меньших количествах присутствует также метилкобаламин. Выделен и ряд других природных аналогов кофермента. Так, псевдовитамин В₁₂ вместо диметилбензимидазола содержит аденин, который, подобно диметилбензимидазолу, соединен с рибозой необычной a-связью. Соединение, называемое фактором А, является аналогом витамина B₁₂, содержащим 2-метиладенин. Целый набор других факторов был выделен из таких источников, как активированный ил отстойников, который изобилует анаэробными бактериями. Предполагают, что в растениях могут содержаться подобные витамину В₁₂материалы, которые не способны поддерживать рост бактерий. Таким образом, вполне возможно, что открыты не все алкилкобальтовые коферменты.

Дополнение 8-Л

Кобаламин (витамин В₁₂)

Начало истории витамина B₁₂^a положили исследования злокачественного малокровия (пернициозной анемии) — заболевания, поражающего в основном пожилых людей, но наблюдаемое иногда и у детей.

До 1926 г. это заболевание было неизлечимым и обычно кончалось смертью. При этом заболевании в организме вырабатываются аномально большие, недоразвитые и нестойкие эритроциты, общее количество которых значительно снижалось (1∙106—3∙106 мм^-3 вместо 4,5∙106—6∙106 мм^-3). По-видимому, блокируется митоз в костном мозге и подавляется синтез ДНК. Заболевание поражает также и другие быстрорастущие ткани, например слизистую оболочку желудка (в результате прекращается секреция НСl) и нервные ткани. Часто наблюдается демиелинизация центральной нервной системы с нарушением координации движений (атаксия) и психотическими расстройствами.

В 1926 г. Мино и Морфи обнаружили, что с пернициозной анемией можно справиться, если употреблять в пищу сырую или слегка поджаренную печень из расчета 1/4 кг в день — процедура, которую не все больные принимали с энтузиазмом. И только 22 годами позднее был выделен витамин В₁₂ (в виде кристаллического производного — цианкобаламина) и было показано, что именно он является целительным агентом. Его содержание в печени составляет приблизительно 1 мг/кг, или ~10^-6 М. Хотя было предпринято множество попыток получения концентрированных экстрактов печени для лечения пернициозной анемии, отсутствие методов анализа, иных, чем лечение больных людей, замедлило прогресс в этом направлении.

В начале 40-х годов изучение питания молодых животных, получавших рацион с недостаточным содержанием животных белков и охраняемых от контакта с их собственными экскрементами (которые содержат витамин В₁₂), продемонстрировало потребность в «факторе животного белка», который вскоре был идентифицирован как витамин В₁₂. В опытах с животными было показано также, что отработанная ферментационная среда стрептомицетов, такая, какую используют для получения стрептомицина и других антибиотиков, чрезвычайно богата витамином В₁₂. Успехам в выделении витамина В₁₂ в значительной мере способствовало признание его роли в качестве фактора роста штамма Lactobacillus lactis. Концентрация витамина, при которой скорость его роста была равна половине максимальной, составляла всего 0,013 мкг/л (10-11 М).

Другим направлением исследований, важным для понимания роли витамина В₁₂, было изучение аномально высокой потребности жвачных животных в кобальте. Вероятно, эта потребность обусловлена необходимостью витамина В₁₂ для микроорганизмов рубца. В тех областях Земли, где содержание кобальта в почве мало, например в Австралии, серьезной проблемой является недостаточность кобальта у овец и крупного рогатого скота.

В 1948 г. красные кобальтсодержащие кристаллы витамина В₁₂ практически одновременно изготовили две крупные фармацевтические фирмы. После адсорбции витамина В₁₂ из экстрактов печени активированным углем использовали элюцию спиртом и множество других методов фракционирования. Позже выяснилось, что более богатым источником витамина могут служить жидкие ферментационные среды.

Структура. Химические исследования показали, что новый витамин имеет очень большой молекулярный вес, содержит один атом фосфора, который можно отщепить в виде P_i, молекулу Dg-1-aминно-2-пропанола и рибофуранозид диметилбензимидазола с необычной a-конфигурацией. Отметим, что структура диметилбензимидазола родственна и кольцевой системе рибофлавина (дополнение 8-И). При гидролизе может также высвободиться несколько молекул аммиака из амидных связей кобаламина. Однако все попытки обратимо отделить кобальт из молекулы витамина оставались безрезультатными.

Структура витамина В₁₂ была определена Дороти Ходжкин и ее сотрудниками в 1956 г методом дифракции рентгеновских лучей^б. В то время это была самая крупная органическая молекула, структуру которой удалось определить методами рентгеноструктурного анализа Полный лабораторный синтез был завершен в 1972 ^г.в

Циклическая система витамина B₁₂ подобна циклической системе порфиринов (рис. 10-1); она состоит из четырех пиррольных колец, биосинтетическое родство которых с соответствующими кольцами порфиринов очевидно. Дополнительно присутствует ряд «избыточных» метальных групп. В корриновом кольце витамина B₁₂имеется менее обширная система сопряженных двойных связей, чем в порфиринах, и как результат большое число хиральных центров, расположенных попериферии колец, несколько выходящих из плоскости объединенного цикла.

Первоначально выделенная форма витамина В₁₂, цианкобаламин, содержит цианид-ион, занимающий одно из координационных положений атома кобальта. Содержание этой формы в природных материалах незначительно (если она вообще присутствует в них), однако цианкобаламин образуется при добавлении цианид-иона в процессе выделения. В природе существует гидроксо- или аквокобаламин (В_12а), содержащий ОН^-, а не CN^-. Однако преобладающими формами являются коферментные формы В₁₂, в которых CN^-заменен на алкильную группу.

Суточная потребность. Внутримышечное введение столь малого количества кристаллического витамина В₁₂, как 3— 6 мкг, достаточно, чтобы вызвать ремиссию у пациента, больного пернициозной анемией, а доза 1 мкг в день достаточна для поддержания результатов лечения (для этой цели чаще всего вводят аквокобаламин один раз в две недели). Необходимая пероральная доза, вероятно, значительно (в 2—50 раз) больше, обычно не составляет никакого труда покрыть эту потребность за счет обычной пищи. Витамин В₁₂ отличается тем, что он синтезируется главным образом бактериями, а большинство растений содержит его в небольшом количестве или не содержит вообще. Поэтому симптомы пернициозной анемии иногда наблюдаются у стропих вегетарианцев.

К пернициозной анемии обычно приводит не отсутствие в рационе витамина В₁₂, а плохое его всасывание. Всасывание зависит от наличия так называемого «внутреннего» фактора — мукопротеида (или мукопротеидов), вырабатываемогослизистой желудка. Люди, больные пернициозной анемией, часто имеют наследственную предрасположенность к пониженному синтезу внутреннего фактора. Гастроэктомия (при которой снижается количество синтезируемого внутреннего фактора) и заражение широким лентецом (который конкурирует за имеющийся витамин В₁₂ и нарушает его всасывание) также могут спровоцировать болезнь.

Нормальный уровень витамина В₁₂ в крови составляет ~2∙10^-10 М или немного выше, однако у вегетарианцев этот уровень может опускаться ниже половины этой величины. Недостаточность фолиевой кислоты также может вызывать мегалобластическую анемию, а большой избыток фолиевой кислоты может в некоторой степени уменьшить анемию у пациентов, больных злокачественным малокровием Опасение, что потребление больших количеств фолиевой кислоты может помешать диагностике пернициозной анемии и в то же время вызвать серьезные психические расстройства, привело к тому, что в 1960 г. в США специальное агентство, занимающееся вопросами, связанными с пищевыми продуктами и лекарственными препаратами (Food and Drug Agency), постановило, что содержание фолиевой кислоты в таблетках поливитаминных препаратов не должно превышать 25 мг. Однако этого количества фолиевой кислоты, по-видимому, не хватает при состояниях организма, связанных с высокой потребностью в этом витамине, например на последних трех месяцах беременности. Некоторые авторитетные специалисты полагают, что опасность маскировки недостаточности витамина В₁₂ фолиевой кислотой сильно преувеличена.

^а История открытия витамина Ви обсуждается в работе [161].

^б Hodgkin D. Н. (1965). Science, 150, 979—988.

^в См. сообщение в Science, 179, 266—267 (1973).