Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 2 - Д. Мецлер 1980
О том, как электроны встречаются с кислородом, как при этом образуется ATR и о некоторых родственных явлениях
Гемопротеиды
Кислородпереносящие белки
В гл. 4, разд. Д, 5, мы рассматривали замечательную способность гемоглобина эритроцитов к кооперативному связыванию четырех молекул О2, а также структурные взаимоотношения гемоглобина и мономерного миоглобина мышц, который способствует диффузии О2 в ткаий [5] и, вероятно, используется для депонирования кислорода. Железо в гемоглобине и миоглобине всегда находится в ферроформе. В эритроцитах имеется специальная система для восстановления железа, если оно случайным образом перейдет в феррисостояние (см. гл. 4, разд. Д, 7, а также дополнение 10-А). Согласно наиболее распространенной точке зрения, при связывании О2 с железом гема не происходит временного изменения состояния окисленности металла. Однако на этот счет имеются и другие суждения [6]. Согласно Ингрэму, окисление металла не происходит из-за упомянутых выше трудностей в присоединении одного электрона к молекуле кислорода. В то же время перенос двух электронов от металла на кислород затруднен, поскольку состояние Fe(IV) является неустойчивым.
Обычно полагают, что связывание железа гема с кислородом происходит путем передачи пары электронов от кислорода металлу. В неоксигенированном гемоглобине ферроион находится в «высокоспиновом» состоянии; четыре из пяти 3d-орбиталей валентной оболочки иона железа содержат по одному неспаренному электрону. Присоединение кислорода переводит железо в «низкоспиновое» состояние, в котором все электроны спарены. Именно эта потеря гемоглобином парамагнетизма при его оксигенировании уже с давних пор привлекла внимание химиков. По имеющимся представлениям, устойчивость гем-кислородных комплексов усиливается «наведенной двойной связью», образующейся благодаря переключению электронной пары одной из d-орбиталей атома железа на образование п-связи с ближайшим атомом кислорода. Символически это можно изобразить следующим образом:
Из этих структур, основанных на предположении, что начальная связь с металлом образуется за счет неподеленной пары электронов молекулы О2, следует как наиболее вероятная наклонная геометрия образующейся структуры, которая недавно была однозначно подтверждена для одного из модельных комплексов [8]:
Выдвигалась также идея о том, что в образовании начальной связи принимает участие одна из пар п-электронов кислорода [4]:
Однако реально наблюдаемая геометрия, по-видимому, исключает наличие такой структуры.
Во всех кислородпереносящих гемопротеидах одно из координационных положений железа, находящееся на противоположной стороне от участка связывания кислорода, занято имидазольной группой боковой цепи гистидина. При отсутствии такой группы гем не может присоединять кислород; как известно, координация с гетероциклическими азотсодержащими соединениями благоприятна для образования низкоспиновых комплексов железа. Было получено несколько очень простых соединений, в которых к одному из колец гема присоединена цепь, несущая на конце имидазольную группу; выяснилось, что при подходящей длине цепи эти соединения весьма хорошо воспроизводят способность миоглобина связывать кислород [7, 8].
Подобные же соединения, имеющие в пятом координационном положении пиридиновое кольцо, имеют низкое сродство к кислороду. Таким образом, поляризуемое имидазольное кольцо, по-видимому, тоже играет существенную роль, способствуя связыванию кислорода. Высказывалось предположение, что в связывании с железом принимают участие п-электроны имидазольного кольца [уравнение (10-2)] [7]. Система п-связей, охватывающих атом железа, позволяет ему образовывать более прочную связь с атомом кислорода, занимающим шестое координационное положение.
Схема, приведенная в уравнении (10-2), иллюстрирует еще одно свойство, часто наблюдаемое у гемопротеидов. N—Н-группа имидазола связана водородной связью с С=О-группой остова пептидной цепи. Далее уже нетрудно представить себе цепь изменений, порождаемых оксигенированием, включая изменение в положении протона, участвующего в упомянутой водородной связи, и дальнейшее перераспределение заряда в сети водородных связей белка1).
Было сделано необычайно интересное открытие, заключающееся в том, что координация гемового железа с гистидином, по всей видимости, лежит в основе кооперативности при связывании гемоглобина с кислородом [9, 10]. Радиус высокоспинового железа как в ферри-, так и в ферросостоянии столь велик, что железо не помещается в центре порфиринового кольца и cмещается в сторону координационно связанной с ним имидазольной группы на расстояние, составляющее для Fe (II) 0,06 нм. Таким образом, в дезоксигемоглобине и железо, и имидазольная группа находятся от плоскости кольца дальше, чем в оксигемоглобине. В последнем железо находится в центре порфиринового кольца, так как переход в низкоспиновое состояние сопровождается уменьшением ионного радиуса [9, 11]. Изменение конформации белка, индуцированное небольшим смещением иона железа, уже было описано (гл. 4, разд. Д,5). Однако истинная природа «пускового механизма», приводящего к этим изменениям, пока в точности не ясна. С некоторым приближением эти изменения можно рассматривать как чисто механические последствия укорочения расстояния между порфириновым кольцом и F-спиралью гемоглобина (рис. 4-17). Высказывались соображения, что это укорочение вызывает наклон гема, ослабляющий некоторые водородные связи в структуре белка и приводящий в результате к уже описанным конформационным изменениям (гл. 4, разд. Д, 5) [10]. Правда, при таком рассмотрении недостаточно внимания уделяется изменениям в распределении электронов, о котором говорилось в предыдущем параграфе. Во всяком случае, замечательно, насколько эффективно природа воспользовалась небольшими различиями в свойствах железа, индуцированными изменением в распределении электронов по d-орбиталям этого переходного металла. Следует иметь в виду возможность того, что и в других биохимических структурах ионы переходных металлов могут индуцировать подобные же конформационные измерения.
1) Карбонильная группа, показанная в уравнении (10-2), в гемоглобинах входит в состав F-спирали и связана водородной связью с другими амидными группами. Оттягивание электрона в гем-кислородный комплекс приведет к усилению водородной связи, показанной в уравнении (10-2), и к ослаблению конкурирующей с ней внутриспиральной водородной связи. Следствием этого будет перераспределение заряда в верхней части F-спирали, способствующее возникновению конформационных изменений, с последующей перестройкой структуры, показанной на рис. 4-19. Непосредственно за F- и G-спиралями находится ß,а2-контакт, в области которого происходят изменения в системе водородных связей.
Переносчиком кислорода в нескольких группах беспозвоночных, например в плодовых червях Sipunculidoidea, служит белок, содержащий негемовое железо, гемэритрин [11а]. Субъединицы этого белка, содержащие около 113 аминокислотных остатков, часто образуют октамеры с симметрией С4. В каждом мономере имеется активный центр, содержащий два атома Fe(II) на расстоянии 0,34 нм друг от друга. Считается, что молекула кислорода располагается между атомами железа, как указано на представленной ниже схеме (взятой из работы Клотца и др. [11а]):
Полагают, что молекула О2 принимает два электрона, окисляя оба атома железа до состояния Fe(III), а сама превращается в перекисный дианион О2-3. Процесс полностью обратим. Превращение кислорода в связанный перекисный ион подтверждается изучением резонансных спектров комбинационного рассеяния (см. гл. 13, разд. Б, 3,6).
Подобным же образом и голубой медьсодержащий гемоцианин многих беспозвоночных связывает одну молекулу О2 на два атома Cu(I). Вероятно, кислород образует мостик между двумя атомами меди. Поскольку СО с этим белком не связывается (как это имеет место в случае железа гемоглобина), Ингрэм [4] предложил для комплекса нелинейную конфигурацию. Оксигенированное соединение имеет яркий голубой цвет и поглощает свет в 5—10 раз сильнее, чем другие известные комплексы одновалентной меди. Исходя из этого, считают, что часть атомов меди при связывании кислорода может менять состояние окисления. Дальнейшим подтверждением этой идеи послужило наблюдение, показавшее, что oбpaботка, оксигенированного гемоцианина ледяной уксусной кислотой приводит к образованию ионов одновалентной и двухвалентной меди в эквивалентных количествах:
(CuО2Cu)2++ Н+ → Cu2+ + Сu+ + НO2. (10-3)
Еще одним продуктом, как полагают, является гидроперекисный радикал. Гемоцианины представляют собой крупные олигомерные молекулы, имеющие очень интересный вид под электронным микроскопом [11b, 11с]
Многие железосодержащие и медьсодержащие белки связывают O2 подобно гемоглобину, миоглобину и гемоцианину, однако затем кислород «активируется» и вступает в дальнейшие реакции. Мы рассмотрим далее и эти ферменты, но сначала рассмотрим группу гемсодержащих ферментов, выполняющих функции переносчиков электронов.
Дополнение 10-А
Глутатионпероксидаза и аномалии эритроцитов
Процессы, благодаря которым гемоглобин поддерживается в Fe (II)-состоянии и нормально функционирует в интактных эритроцитах, имеют решающее значение для нашего здоровья. Многочисленные наследственные нарушения, приводящие к развитию анемии, помогли выяснить приведенную схему биохимических процессовa.
Около 90% глюкозы, усваиваемой эритроцитами, превращается в процессе гликолиза в лактат, но ~10% окисляется (через образование глюкозо-6-фосфата) в 6-фосфоглюконат. Это окисление (реакция а) катализируется глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназой [уравнение (8-42)] с участием NADP+. Именно эта реакция в основном обеспечивает эритроциты необходимым количеством NADPH, используемым ДЛЯ восстановления глутатиона (дополнение 7-Ж) в ходе реакции б, Глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназа имеет очень важное значение, и все же свыше 100 млн. человек, особенно в тропических и средиземноморских странах, имеют наследственный недостаток этого фермента. Как оказалось, генетически эти нарушения весьма разнородны — обнаружено уже по меньшей мере 22 типа такого рода нарушений. Установлено, что отсутствие этого фермента приводит к весьма серьезным последствиям: при некоторых заболеваниях, а также в ответ на введение определенных лекарственных препаратов наблюдается разрушение большого количества эритроцитов. Выживаемость дефектных генов, как и в случае серповидноклеточной анемии (дополнение 4-Г), по-видимому, обусловлена повышенной сопротивляемостью людей, имеющих такие гены, к малярии.
Другие дефекты эритроцитов, обусловливающие повышенную чувствительность к лекарственным препаратам, связаны с недостатком глутатиона (из-за снижения скорости его синтеза) или с недостатком глутатионредуктазы (реакция б). Как выяснилось, в этих случаях причиной нарушений, вызываемых введением лекарств, является образование Н2О2 (реакция г). Согласно существующим в настоящее время представлениям, функция глутатиона и ферментов, катализирующих реакции а, б и в, состоит в разрушении перекиси водорода, образующейся либо в результате обменных реакций, либо при автоокислении лекарственных препаратов. В эритроцитах человека главным ферментом, разрушающим Н2О2 (реакция в), является селенсодержащая пероксидаза (дополнение 9-Е); вероятно, такую же функцию выполняет каталаза [уравнение (10-5)], и для нормальной жизнедеятельности организма, по-видимому, необходимы оба фермента.
Избыток Н2О2 повреждает эритроциты двумя путями. Во-первых, происходит слишком энергичное окисление функционирующего гемоглобина в Fe (III)-содержащий метгемоглобин (метгемоглобин образуется также и самопроизвольно в процессе переноса гемоглобином кислорода; по имеющимся оценкам, в течение суток до 3% гемоглобина может окисляться в метгемоглобин). Образовавшийся метгемоглобин снова восстанавливается в гемоглобин под действием NADH-метгемоглобин—редуктазы (реакция е). Меньшая доля метгемоглобнна восстанавливается под действием сходного NADPH-зависимого фермента (как указано стрелкой идущей от NADH к реакции е). Известны случаи наследственного недостатка NADH-метгемоглобин—редуктазы.
Второй повреждающей функцией Н2О2 является атака двойных связей ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран. Образующиеся в результате гидроперекиси жирных кислот могут вызвать дальнейшие реакции, приводящие к разрыву связей С—С и разрушению мембраны. Именно это считается главной причиной гемолитической анемии, развивающейся у некоторых пациентов при введении лекарственных препаратов. Глутатионпероксидаза, по всей вероятности, разрушает также перекиси жирных кислот. Для поддержания эритроцитов в нормальном состоянии требуется также витамин Е, обладающий антиоксидантным действием (дополнение 10-В).
Некоторые случаи грануломатоза (разд. Б, 6) сопровождаются снижением активности глутатионпероксидазы, а также снижением микробицидной активности фагоцитов. Предполагают, что гидроперекиси жирных кислот нарушают нормальный фагоцитоз, ингибируя определенные ферментыб.
а Chanarin I. In: Biochemical Disorders in Human Disease, 3rd ed. (R. H. S. Thompson and I. D. P. Wooton, eds.), pp. 163—173, Academic Press, New York, 1970.
б Serfass R. E., Ganther H. E., Nature (London), 255, 640—641 (1975).
Дополнение 10-Б
Ванадий
На возможную биохимическую функцию ванадия указывает наличие ванадоцитов, зеленых кровяных клеток, содержащих 4% V(III) и 1,5—2 н. H2SO4. Эти клетки были обнаружены в оболочниках (морских водоструйных животных, гл. 1, разд. Д,1)а. Было высказано предположение, что V-co- держащий белок ванадохром является переносчиком кислорода. Однако полной определенности на этот счет пока нет, и функция этого белка остается неясной. Ванадий накапливается рядом других морских организмов и присутствует в животных тканях в количестве ~0,1 части на миллион.
Недавно было показано, что крысы обязательно должны получать ванадий с пищейб,в. Вероятно, он необходим также и человеку, обычно потребляющему ~2 мг ванадия в день. Организм взрослого человека содержит ~30 мг ванадия. Возможная функция связана с метаболизмом липидов. Ванадий может находиться в разных состояниях окисления, от +2 до +5. В щелочном растворе ванадий присутствует преимущественно в виде иона VO3-4, содержащего пятивалентный ванадий. Ион ванадия VО2+, имеющий двойную связь, является особенно устойчивой формой V(IV). Химические свойства ванадия позволяют считать, что он может выполнять окислительно-восстановительные функции.
Внимание к ванадию как существенному компоненту пищи привлекли наблюдения, показавшие, что высокие дозы ванадия ингибируют синтез холестерина и снижают содержание в крови фосфолипидов и холестерина. Сообщалось, что ванадий препятствует развитию кариеса зубов, способствуя их минерализации. В отличие от вольфрама (дополнение 14-А) ванадий в организме животного не обнаруживает конкуренции с молибденомг. Однако у Azotobacter была найдена неактивная ванадийсодержащая нитрогеназа.
а Carlisle D. В., Proa Roy. Soa, B, 171, 31—42 (1968).
б Schwarz К., Milne D. B« Science, 174, 426—428 (1971).
в Hopkins L. L., Ir. In: Trace Element Metabolism in Animals (W. A. Hoekstra, J. W. Suttie, H. E. Ganther and W. Mertz, eds.), Vol. 2, pp. 397—406, University Park Press, Baltimore, 1974.
г Johnson J. L., Rajagopalan К. V., Cohen H. J., JBC, 249, 859—866 (1974).