Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 2 - Д. Мецлер 1980

Ферменты: белковые катализаторы клеток
Основы ферментативной кинетики
Диффузия и число активных соударений фермента с субстратом

Какие факторы определяют, величину k₁ в уравнении (6-14)? Эта константа скорости характеризует процесс, в ходе которого субстрат и фермент «находят» друг друга, соответствующим образом ориентируются и связываются с образованием комплекса ES. Если ориентация и связывание происходят достаточно быстро, то скорость реакции будет определяться скоростью сближения молекул за счет диффузии. Из-за частых столкновений с молекулами растворителя расстояния, на которые могут свободно перемещаться в растворе молекулы растворенного вещества, не превышают ничтожных долей их диаметра. Диффундирующие молекулы поворачиваются, вращаются, «протискиваются» между другими молекулами. Визуально этот процесс проявляется в броуновском движении микроскопических частиц, суспендированных в жидкости. Наблюдая за индивидуальной частицей, можно увидеть, что она случайно блуждает в растворе, двигаясь то в одном, то в другом направлении. Эйнштейн показал, что если измерить расстояние ∆х, на которое перемещается частица за интервал времени ∆t, то средний квадрат смещения ∆х (∆²) будет пропорционален ∆t:

    ∆² = 2_D∆t,       (6-21)

где D — коэффициент диффузии, обычно измеряемый в см²∙с^-1.

1) В случае выполнимости уравнения Михаэлиса — Ментен максимальный наклон зависимости v от lg [S] равен 2,303 V_max/4 = 0,576 V_mаx и, следовательно, величину V_mах можно определить, разделив максимальный наклон на 0,576. — Прим. перев.

Наблюдать непосредственно за броуновским движением молекул невозможно, однако коэффициент диффузии для них может быть измерен, например, по скорости размывания границы между двумя растворами с разными концентрациями данного вещества [13]. Коэффициент диффузии для ¹Н²НО (HDO) в Н₂O при 25°С составляет 2,27∙10^-5 см²∙с^-1; тот же порядок имеют коэффициенты диффузии для ионов К⁺ И Сl^- [14]. Для многих небольших молекул D ≃ 10^-5 см²∙с^-1 и уменьшается с увеличением размера молекулы. Так, для рибонуклеазы (мол. вес 13 683) D = 1,1∙10^-6см²∙с^-1, для миозина (мол. вес 5∙10⁵) D ≃ 1∙10^-7 cм²∙c^-1. Коэффициент диффузии связан с радиусом сферической частицы r, вязкостью η и константой Больцмана k соотношением, известным под названием уравнение Стокса — Эйнштейна:

Чтобы оценить константу скорости реакции, которая контролируется частотой столкновения частиц, мы должны определить, сколько раз в секунду одна из п частиц соударяется с другой в результате броуновского движения. Впервые подход к решению этого вопроса был разработан в 1917 г. Смолуховским [15, 16], оценившим скорость, с которой частица В диффундирует ко второй частице А и вступает с ней в реакцию. Используя закон диффузии Фика, Смолуховский пришел к заключению, что число активных соударений в 1 мл за 1 с равно

Число активных соударений = 4π (D_A+ D_B) (r_A + r_B) n_An_B,       (6-23)

где D_А и D_В — коэффициенты диффузии для частиц А и В соответственно, r_A и r_B — радиусы этих частиц, n_A и n_B — число частиц А и В в 1 мл. Число активных соударений в 1 л за 1 с равно (4π/1000) (D_A+D_B) (r_A+r_B)N²[А] [В], где N — число Авогадро. Если поделить эту величину на N, то мы придем к скорости столкновений v (выраженной в М∙с^-1), которая равна скорости бимолекулярной реакции k_D[А][В] (где k_D — константа скорости второго порядка):

Выражение (6-25) дает слегка завышенные значения константы скорости, лимитируемой диффузией, но является все же достаточно хорошим приближением.

Если предположить, что диффундирующие частицы имеют сферичеcкую форму, то коэффициенты диффузии D_A и D_B можно рассчитать, при помощи уравнения (6-22); тогда уравнение (6-25) принимает следующий вид:

Обратите внимание на то, что величина k_D мало меняется при варьировании отношения радиусов r_А/r_B. В большинстве случаев можно допустить, что r_A ≈ r_B, и тогда уравнение (6-26) сводится к

Bязкость воды при 25°С равна — 0,01 П (1 П=10^-5 Н∙см^-2), и из уравнения (6-27) мы получаем, что k_D≈0,7∙10¹⁰ М^-1∙с^-1. Как показал Дебай [17], проведенные расчеты верны лишь для незаряженных сферических частиц; в случае же заряженных частиц константу скорости k_D нужно умножить на поправочный множитель. Этот поправочный множитель для субстрата и фермента, несущих два-три заряда, равен 5—10 и приводит к увеличению или уменьшению скорости реакции (в зависимости от знака заряда).

Другой, довольно простой вывод уравнения (6-27) предложил Д. Френч¹). Рассмотрим небольшой элемент объема ∆V, захватываемый частицей при ее перемещении в растворе на расстояние, равное ее собственному радиусу. Этот элемент объема равен

∆V = πr² x r = πr³       (6-28)

и захватывается за интервал времени, который можно оценить из уравнения (6-21): ∆t = r²/2D. Подставляя сюда выражение для D (6-22), получаем следующее соотношение:

Из уравнений (6-28) и (6-29) находим объем, захватываемый одной частицей за 1 с:

Поскольку радиус столкновения двух частиц одинакового размера равен удвоенному радиусу частицы, эффективный объем, захватываемый двумя частицами, будет в четыре раза превышать объем, определяемый уравнением (6-30). Так как диффундируют обе частицы, эффективный коэффициент диффузии вдвое больше того коэффициента диффузии, который фигурирует в уравнении (6-25). В результате эффективный объем, захватываемый частицей за 1 с, будет в восемь раз превышать объем, рассчитанный по формуле (6-30). Объем, захватываемый одним молем частиц, равен k_D (напомним, что константа скорости второго порядка имеет размерность л∙моль^-1∙с^-1). Таким образом, если выражение (6-30) умножить на 8 и перейти к молярной концентрации, то оно будет идентично уравнению Смолуховского (6-27).

Уравнение (6.30) дает значение объема ∼1,4∙10^-11 см³, который соответствует объему куба с ребром ~2,4 мкм. Если мы сопоставим эту величину с объемом клетки (см. табл. 1-2) или органеллы, то увидим, что объем, захватываемый молекулой фермента за 1 с, составляет довольно заметную часть объема небольшой по размеру клетки, митохондрии, хлоропласта и т. д.