Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 3 - Д. Мецлер 1980

Биохимическая генетика и синтез нуклеиновых кислот и белков
Генетические методы
Установление соответствия между генетической картой и аминокислотными последовательностями

Хотя исследования rII-области хромосомы бактериофага Т4 показали, что генетическое картирование может быть выполнено на уровне отдельных нуклеотидов в ДНК, необходимо было все-таки доказать наличие линейного соответствия между последовательностями нуклеотидов в ДНК н аминокислотными последовательностями в белках. Это удалось сделать Яновскому и сотр. [134] в опытах с триптофансинтетазой Е. coli, а также Сарабхай и др. [134а] при изучении белка оболочки фага Т4.

Триптофансинтетаза (стр. 141) состоит из двух субъединиц А и В (или а и β), первая из которых содержит всего лишь 268 аминокислот. Тонкую структуру гена А удалось картировать следующим образом. Было выделено большое число мутантных бактерий, неспособных расти на среде, не содержащей триптофана (ауксотрофы по триптофану). Генетические скрещивания проводились с помощью специального трансдуцирующего бактериофага Pike [134]. В процессе размножения в чувствительных к ним бактериях трансдуцирующне бактериофаги иногда включают в собственную ДНК часть бактериальной хромосомы. В дальнейшем, когда такой фаг заражает другие бактерии, часть его генетической информации может переноситься в результате рекомбинации в хромосомы бактерий, переживших инфекцию. Используя серии мутантов с делениями аналогично тому, как это было сделано при картировании гена rІІ, удалось разделить ген А на ряд участков, а исследование частоты рекомбинаций позволило осуществить точное картирование.

Вторая часть доказательства коллинеарности между нуклеотидной последовательностью в ДНК и последовательностью аминокислот в белках включала в себя определение полной аминокислотной последовательности триптофансинтетазы и картирование пептидных фрагментов мутантных ферментов (гл. 2, разд. 3,2). Пептидные карты позволили идентифицировать дефектные пептиды и точно установить природу аминокислотных замещений в большом числе различных ауксотофов по триптофану. Когда это было сделано, оказалось, что мутациям, локализованным очень близко друг к другу, соответствовали аминокислотные замещения в непосредственно (или очень близко) прилегающих друг к другу участках полипептидной цепи.

Изучением той же проблемы занимались Сарабхай и сотр. [134а], которые исследовали nonsence-мутации (разд. 5), приводящие к преждевременной терминации синтеза полипептидной цепи. На поздних стадиях заражения Е. coli фагом Т4 белковый синтез направлен в основном на синтез одного белка, а именно белка головки вируса. После проведения синтеза белка в нифицированных клетках в присутствии специфически меченных ¹⁴С аминокислот клеточные экстракты обрабатывали трипсином или химотрипсином; пептиды белка головки фага разделяли методом электрофореза и с полученных электрофореграмм снимали радиоавтографы. Было показано, что ряд nonsence-мутантов фага Т4, у которых мутации локализованы в пределах гена белка оболочки, синтезируют неполные цепи белка оболочки фага, причем полученные пептидные фрагменты были разной длины. Исследуя радиоавтографы, полученные с электрофореграмм ферментативно фрагментированных пептидов, можно было расположить мутанты в ряд по уменьшению длины образуемых пептидов. При этом удалось показать, что полученная таким образом последовательность соответствует той последовательности, которую можно предсказать, исходя из результатов генетического картирования.

Выше уже говорилось о том, что коллинеарность последовательностей кодонов и аминокислот была доказана путем прямых определений нуклеотидных последовательностей в молекулах РНК и ДНК и соответствующих последовательностей аминокислот в белках (разд. В, 2, и).

Еще до того как была окончательно установлена триплетная природа кодонов, Крик и его сотрудники, остроумно использовав мутации со сдвигом рамки, доказали, что генетический код действительно составлен из нуклеотидных триплетов. Рассмотрим, что произойдет при спаривании двух штаммов бактерий, каждый из которых несет мутацию со сдвигом рамки (например, делецию —1). В результате генетической рекомбинации могут образоваться мутанты, содержащие обе мутации со сдвигом рамки. Однако распознать такие рекомбинанты будет трудно, так как (согласно практически любой теории кодирования) они по-прежнему будут продуцировать полностью дефектные белки. Крику и его сотрудникам удалось, однако, ввести в тот же ген третью мутацию со сдвигом рамки того же типа и наблюдать, что рекомбинанты, несущие все три делеции (или вставки), были способны синтезировать, по крайней мере частично, активные белки. Это объясняется просто. Делеции одного или двух нуклеотидов полностью инактивируют ген, тогда как при делеции трех нуклеотидов, расположенных в пределах одного гена и близко друг от друга, ген укорачивается лишь на три нуклеотида. В гене будет содержаться в этом случае лишь небольшая область с измененными кодонами. Кодируемый белок будет нормальным, за исключением небольшого участка, в котором некоторые из аминокислот будут заменены, а одна будет полностью отсутствовать. Мы уже знаем, что в большинстве белков полностью инвариантна лишь сравнительно небольшая доля аминокислот. Таким образом, очень часто ген, в котором модифицирована небольшая область, может синтезировать функционально активные продукты при условии, что не произошло сдвига рамки считывания.