Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы очистки белков

Для любых исследований белка, будь то определение его структуры или биологической функции, этот белок нужно иметь, прежде всего, в очищенном от примесей виде. Осуществить это на практике трудно, поскольку природа не синтезирует белки вне живой клетки. Поэтому, после разрушения клеток всегда получается очень сложная смесь. Как правило, процедура выделения и очистки белка - это многостадийная обработка исходного биологического материала. На каждой из следующих друг за другом стадий удаляется часть посторонних веществ и так до тех пор пока белок не будет получен в чистом виде. Ясно, что на каждой из стадий происходит не только очистка, но и безвозвратная потеря большего или меньшего количества белка. Обычно, удается получить в чистом виде 5-10% исходного белка.

Универсальной методики очистки белков нет. Каждый следующий шаг выбирается методом проб и ошибок, а успех зависит от эрудиции, точных знаний и интуиции экспериментатора. Подходящим (приемлемым) путем очистки считается тот, при котором можно получить (сохранить) максимальное количество белка в наиболее очищенном состоянии. Если этот результат можно достичь в 4-6 стадий, то им можно быть вполне довольным.

В качестве примера рассмотрим результаты полученные Анраку (Anraku) при выделении галактозосвязывающего белка из клеток E. Coli (см. табл.4.2). Выделяемый (галактозосвязывающий) белок связывает простые сахара и участвует в транспорте их через бактериальную клеточную мембрану.

Обработка протамином (стадия 2) не приводит к заметному отделению балластных белков (остается 2352 из 2600 мг). Протамин используют для удаления из гомогената ДНК и РНК путем осаждения. Третий этап - фракционирование сульфатом аммония - широко применяемый прием при выделении белков. Сульфат аммония понижает растворимость белков (эффект высаливания).

Три последние стадии - хроматографическое разделение на ионообменниках и гель-фильтрация на ДЭАЭ-сефадексе.

Таблица 4.2 Последовательность процесса выделения галактозосвязывающего белка из клеток E.Coli

* Выход (в%) - есть отношение общей активности на данной стадии к общей активности исходного экстракта

Общее количество белка определяли по методу Лоури. Суммарную активность измеряли так. Помещали белковую фракцию в полупроницаемую трубку и проводили диализ в течении нескольких часов против раствора, содержащего известное количество ¹⁴С-галактозы. Затем определяли наведенную, за счет связывания белком меченой галактозы, радиоактивность образца.