Принципы структурной организации белков - Г. Шульц 1982

Термодинамика и кинетика свертывания полипептидной цепи
Быстрота, безошибочность и ограничения свертывания in vitro

Свертывание может происходить значительно быстрее, чем синтез цепи. Свертывание in vitro осуществляется чрезвычайно быстро, по крайней мере для малых белков, не содержащих дисульфидных мостиков. Нуклеаза стафилококка повторно свертывается в течение 1 с [438], а метмиоглобин — в течение 10 с [4391. Если эти величины применимы также и к условиям in vivo, свертывание цепи может происходить по крайней мере в 10 раз быстрее, чем биосинтез аминокислотной последовательности. Дисульфидсодержащие белки, например панкреатическая рибонуклеаза, повторно свертываются за время от 1 до 10 с, если дисульфидные связи не были разорваны в процессе предшествующей денатурации [440]. Однако если такие белки развернуты и восстановлены, последующее свертывание цепи (которое включает образование правильной системы дисульфидных связей) продолжается при оптимальных условиях в течение многих минут.

Безошибочность свертывания цепи in vitro [94] проверяют путем сопоставления свойств нативного и ренатурированного белков в отношении биологической активности и специфичности [441]. Например, денатурированный различными способами переносчик кислорода — гемоглобин может быть вновь переведен в нативный белок, который а) имеет ту же растворимость, что и исходный белок, б) способен кристаллизоваться, в) имеет спектр поглощения, характерный для нативного гемоглобина, г) может обратимо присоединять кислород, д) обладает тем же относительным сродством к двуокиси углерода и к кислороду и е) с трудом расщепляется трипсином, что указывает на компактную структуру ренатурированного белка.

Повторное свертывание белков, обработанных ферментами, обычно невозможно. Если белки подвергались ферментативному воздействию in vivo, их безошибочное повторное свертывание часто становится невозможным. Примером такого белка является коллаген. Одна из многих проблем повторного свертывания коллагена в условиях in vitro состоит в несовпадении взаимного расположения трех цепей, которые должны при взаимодействии образовывать триплетную спиральную молекулу (рис. 5.6). В случае in vivo проблема снимается обработкой растворимого предшественника коллагена перед его выделением. Глобулярные образования на обоих концах каждой полипептидной цепи обеспечивают правильное расположение вытянутых участков трех цепей коллагена относительно друг друга (рис. 4.4).

Другим примером является инсулин, который не удается ренатурировать, если его нативные дисульфидные связи были разрушены тиолами или если их структура менялась при ферментативных воздействиях [101]. Этот факт стимулировал поиски предшественника, который был действительно обнаружен в форме проинсулина [442]. Проинсулин стабилен к действию фермента дисульфидизомеразы (рис. 4.3); в опытах по денатурации — ренатурации он самопроизвольно повторно свертывается [443]. Протеолитическое расщепление проинсулина in vivo приводит к инсулину, стабильность которого обеспечивается энтропийным вкладом его нативной системы связей S—S (разд. 8.3). Лабильность структуры инсулина имеет, по-видимому, физиологическое значение [444], поскольку скорость инактивации является фактором, контролирующим степень и продолжительность действия гормона.

Повторное свертывание модифицированных белков дает информацию о процессе свертывания. Исследования повторного свертывания нативных белков были дополнены опытами по повторному свертыванию модифицированных белков. В ранних исследованиях [445] было показано, что рибонуклеаза поджелудочной железы, подинированная по расположенному на поверхности нативной структуры Туr-115, после денатурации теряет способность к повторному свертыванию. Эго показывает, что состояние остатка Туr-115 имеет важное значение для процесса свертывания. Для того чтобы установить, можно ли модифицировать белок (путем расщепления цепи и делеций в последовательности или путем присоединения объемных групп к боковым цепям) без потери им способности к свертыванию, был проведен ряд систематических исследований нуклеазы стафилококка и панкреатической рибонуклеазы.

Кроме того, об участии фрагментов полипептидов в процессе свертывания можно судить, используя методы комплементации белка. «Комплементацией» называют восстановление биологической активности с помощью невалентных взаимодействий различных (поли)пептидных цепей [446]. Классический пример комплементации in vitro представляет панкреатическая рибонуклеаза. После того как так называемый S-пептид (включающий 20 N-концевых аминокислотных остатков) отщепляется от белка, последний теряет свою ферментативную активность и способность к повторному свертыванию восстановленной цепи. В результате комплементации белка S-пептидом способность к ферментативному действию и свертыванию восстанавливается, хотя ковалентные связи между двумя пептидными цепями и не образуются [94]. Таким образом, эксперименты по ренатурации (см. обзоры [94, 177]) модифицированных и комплементированных форм белка дают существенную информацию о механизме его свертывания.