Принципы структурной организации белков - Г. Шульц 1982
Термодинамика и кинетика свертывания полипептидной цепи
Структурные элементы в несвернутых цепях
До сих пор по отношению к несвернутой цепи употреблялся термин «термодинамическое состояние». Однако в отличие от нативной структуры несвернутому состоянию соответствует множество конформаций цепи. Тем не менее можно предположить, что некоторый порядок все-таки существует и у несвернутой цепи. Выделение у нее структурированных элементов и тем самым сужение конформационного пространства полезно для рассмотрения процесса свертывания; в этом случае можно выделить зародышевые формы — нуклеации, с которыми взаимодействуют остальные участки цепи.
Эксперименты по повторному свертыванию выявляют быстро и медленно свертывающиеся цепи. Подразделение несвернутых цепей на два класса, быстро и медленно свертывающихся, было установлено при исследовании рибонуклеазы [440, 447, 448]. В опытах по повторному свертыванию рибонуклеазы, денатурированной без нарушения системы дисульфидных связей, было обнаружено, что 20% цепей повторно свертываются в пределах 0,1 с (быстро свертывающиеся цепи.) Процентное содержание таких цепей не зависит от способа денатурации (гуанидин гидрохлорид [449], нагревание [450] и т. д.). Остальные 80% цепей (медленно свертывающихся) превращаются за время от 10 до 100 с в быстро свертывающиеся, которые затем укладываются моментально. Имеется сообщение об аналогичном, хотя и менее количественном наблюдении в отношении ингибитора трипсина поджелудочной железы быка (ВРТІ), в. котором 15% цепей свертывались значительно медленнее, чем остальные [451]. Это явление пока еще не объяснено. Согласно одной из гипотез [449, 452], в быстро свертывающихся цепях все пептидные связи представлены правильными цис-транс-изомерами, тогда как медленно свертывающиеся цепи содержат неправильные изомеры; время расходуется на конверсию неправильных изомеров. Цис-транс-превращение происходит наиболее легко с N-концевой стороны остатка Pro, поскольку в этом случае барьер энергии активации составляет всего около 13 ккал/моль по сравнению с 20 ккал/моль для других пептидных связей (разд. 2.5). И BPTI, и рибонуклеаза содержат четыре остатка Pro, в нативной рибонуклеазе два из них существуют в виде цис-изомеров.
Антитела можно использовать для идентификации зародышей свертывания. Другой путь поиска следов структуры в несвернутых полипептидных цепях состоит в расщеплении нативных полипептидных цепей и в проверке с помощью специфичных антител, который из фрагментов принимает свою нативную конформацию. Большинство из этих экспериментов было выполнено на нуклеазе стафилококка [418; 453]; они показали, что фрагменты величиной от 17 до 120 остатков свертываются в нативную конформацию с константой равновесия К = [N]/[R] ≈ 10-3. Согласно уравнению (3.2), это отвечает невыгодному изменению свободной энергии приблизительно на 4 ккал/моль. В принципе этот метод можно использовать для поиска зародышей свертывания; для этой цели необходимо выделить или синтезировать необходимые фрагменты полипептидной цепи [454]. Стабильные фрагменты, которым соответствуют высокие значения К, наиболее вероятно представляют нуклеации свертывания.
Такие нуклеации должны характеризоваться высокой степенью корреляции с соседними по цепи остатками (раздел 5.3), поскольку именно взаимодействия с ними повышают стабильность промежуточного продукта. Это явствует из формулы Флори для оценки вклада дисульфидных мостиков в энтропию цепи [455]:
где v — число соединенных мостиками цепей (в два раза больше числа мостиков), n' — число статистических сегментов между мостиками, за которое в первом приближении [456] можно принять число остатков между мостиками.
Чем короче цепи между мостиками, тем меньше понижение энтропии при их образовании. Это понижение энтропии вызвано не химическими свойствами, а только уменьшением числа возможных конформаций при образовании дисульфидных связей. Формулу Флори в связи с этим можно использовать для оценки понижения энтропии, необходимого для сближения двух элементов цепи.
Формула Флори количественно показывает, что сильная корреляция с соседними по цепи остатками выгодна. Как следует из уравнения (8.2), необходимое изменение энтропии тем меньше, чем короче цепь между сближаемыми элементами, т. е. чем сильнее корреляция с соседними остатками в соответствующем сегменте цепи. И наоборот, энтропия активации ΔS≠цепь при переходе от несвернутой цепи к нативному состоянию с сильной корреляцией соседних остатков намного меньше, чем ΔS≠цепь, перехода к нативному состоянию со слабой корреляцией. В соответствии с уравнением (3.2) меньшее значение ΔS≠цепь отвечает более низкому барьеру свободной энергии, а следовательно, и более стабильной структуре промежуточного состояния. Таким образом, для свертывания цепи в структуру с сильной корреляцией по соседним остаткам требуется намного меньший вклад связывающей энергии и энтропии растворителя, чем для перехода к структуре со слабой корреляцией. Сильная корреляция по соседним остаткам облегчает процесс свертывания и тем самым заметно увеличивает его скорость.
Вторичные структуры, например а-спирали и ß-слои, являются потенциальными зародышами свертывания, поскольку им свойственна большая связывающая энергия и сильная корреляция с соседними по цепи остатками. В связи с этим нужно отметить, что при повторном свертывании BPTI первый стабильный дисульфидный мостик [451, 457] связывает Cys-30 ß-складчатого листа с Cys-51 а-спирали. На этом участке наблюдается самая сильная корреляция по соседним остаткам (кратчайший сегмент между образующими мостик остатками) в нативной структуре (рис. 8.1).