БИОХИМИЯ - Л. Страйер - 1984

ТОМ 3

Часть IV ИНФОРМАЦИЯ

ГЛАВА 24 ДНК: ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РОЛЬ, СТРУКТУРА И РЕПЛИКАЦИЯ

24.7. Некоторые вирусы содержат на определенных стадиях жизненного цикла одноцепочечную ДНК

ДНК не всегда двухцепочечная молекула. Роберт Синсхеймер (Robert Sinsheimer) обнаружил, что ДНК фага фХ174, небольшого вируса, заражающего Е. coli одноцепочечная молекула. Несколько экспериментальных фактов привели его к этому неожиданному выводу. Во-первых, соотношение оснований в ДНК фага ɸХ174 не удовлетворяет правилу [А] = [Т] и [G] = = [С]. Во-вторых, вязкость раствора ДНК фага ɸХ174 значительно меньше вязкости раствора ДНК Е. coli той же концентрации. Гидродинамические свойства ДНК фага ɸХ174 соответствуют полимеру в конформации случайного клубка. В отличие от этого ДНК в форме двойной спирали ведет себя гидродинамически как очень жесткая палочка. В-третьих, аминогруппы оснований ДНК фага ɸХ174 легко реагируют с формальдегидом, тогда как основания в двойной спирали ДНК почти недоступны для этого реактива.

Обнаружение этой одноцепочечной ДНК породило сомнения в универсальности схемы полуконсервативной репликации, предложенной Уотсоном и Криком. Однако вскоре было показано, что ДНК фага ɸХ174 находится в одноцепочечном состоянии только на протяжении части жизненного цикла вируса. Синсхеймер обнаружил, что зараженные клетки Е. coliсодержат двухцепочечную форму ДНК фага ɸХ174. Эта двухцепочечная ДНК называется репликативной формой, так как она служит матрицей для синтеза ДНК вирусного потомства. Вирусы, содержащие одноцепочечную РНК, также реплицируются через промежуточную двухцепочечную репликативную форму. Механизмы этих процессов подробнее рассматриваются в гл. 30. Здесь же важно лишь подчеркнуть, что эти исследования подтвердили всеобщность схемы репликации Уотсона- Крика. Двухцепочечная ДНК (или РНК) - репликативная форма всех известных генов.

Рис. 24.17. Электронная микрофотография частиц вируса ɸХ174

24.8. Молекулы ДНК очень длинные

Прежде чем перейти к механизму репликации ДНК, представляющему собой сложный ферментативный процесс, рассмотрим некоторые свойства ДНК. Поразительная особенность молекул ДНК, встречающихся в природе, их необычайная длина. Хромосома Е. coli представляет собой единую молекулу двухспиральной ДНК, содержащей 4 млн. пар оснований. Масса этой молекулы ДНК 2,6 • 10⁶ кДа. Она имеет крайне асимметричную форму: ее контурная длина 14 • 10⁶ А, а диаметр 20 А. Контурная длина (1,4 мм) этой молекулы ДНК соответствует размерам макроскопических структур, а диаметр 20 А находится на уровне атомных размеров. Бруно Зимм (Bruno Zimm) показал, что самая большая хромосома у Drosophila melanogaster содержит единую молекулу ДНК, состоящую из 6,2 • 10⁷ пар оснований. Контурная длина этой молекулы 2,1 см. Столь асимметричные молекулы ДНК весьма чувствительны к разрыву под действием сил сдвига. Они легко разрываются на фрагменты, масса которых в 1000 раз меньше, чем масса исходной молекулы, если при манипуляциях с ней не принимаются особые меры предосторожности.

Изображения молекул ДНК многих бактерий и вирусов были непосредственно получены с помощью электронного микроскопа (рис. 24.18). Размеры некоторых таких молекул ДНК приведены в табл. 24.1

Рис. 24.18. Электронная микрофотография молекулы ДНК бактериофага (форма RFII)

Таблица 24.1. Размеры некоторых молекул ДНК

Следует отметить, что даже самые маленькие молекулы ДНК имеют весьма вытянутую форму. Например, ДНК вируса полиомы содержит 5100 пар оснований и имеет контурную длину 1,7 мкм (17000 А). Напомним, что диаметр молекулы гемоглобина составляет 65 А, а длина коллагена, одного из самых длинных белков, 3000 А. Это сравнение подчеркивает огромную длину и выраженную асимметрию молекул ДНК.

Для измерения длин молекул нуклеиновых кислот применяется единица длины, равная 1000 пар нуклеотидов в случае двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот (т.п.н., или kb - от англ. kilobase) или 1000 нуклеотидов в случае одноцепочечных молекул (т.н., или kb). 1 kb двухцепочечной ДНК имеет контурную длину 0,34 мкм и массу примерно 660 кДа.

24.9. Двойная спираль может быть обратимо расплавлена

Две цепи ДНК-спирали могут легко разойтись, если разрушить водородные связи, соединяющие спаренные основания. Этого можно достичь, либо нагревая раствор ДНК, либо добавляя в раствор кислоту или щелочь для ионизации оснований. Раскручивание двойной спирали называется плавлением, так как происходит мгновенно при строго определенной температуре. Температура плавления (Т_пл) - это та температура, при которой разрушается половина спиральной структуры. Резкость этого перехода показывает, что двойная спираль ДНК - структура высококооперативная. Плавление ДНК легко регистрировать, измеряя ее поглощение при 260 нм. Нарушение межплоскостных взаимодействий пар оснований приводит к увеличению поглощения - эффект, называемый гиперхромизмом (рис. 24.19).

Рис. 24.19. При плавлении двойной спирали, когда она переходит в одноцепочечную форму, поглощение раствора ДНК при 260 нм возрастает

Температура плавления молекулы ДНК существенно зависит от ее нуклеотидного состава. Молекулы ДНК, богатые GC- парами оснований, имеют более высокие значения Т_пл, чем молекулы, богатые АТ-па- рами оснований (рис. 24.20). В общем Т_пл

Рис. 24.20. Кривые плавления различных ДНК. На графике отложено относительное поглощение при 260 нм в зависимости от температуры (поглощение при 25°С принято за 1). Т_плравна 69°С для ДНК Е. coli (50% GС-пар) и 76°С для ДНК. P. aeruginosa (68% GС-пар)

ДНК многих видов повышается линейно от 77 до 100°С с увеличением содержания GC-пар от 20 до 78%. GC-пары стабильнее АТ-пар, так как в них основания удерживаются вместе тремя водородными связями, а не двумя. Следовательно, АТ-богатые области ДНК должны плавиться первыми (рис. 24.21). Как мы увидим ниже, in vivo двойная спираль расплетается под действием специальных белков. Некоторые из них вызывают раскручивание ДНК, гидролизуя АТР (разд. 24.21).

Рис. 24.21. Электронная микрофотография молекулы ДНК, частично расплетенной под действием щелочи. Одноцепочечные участки имеют вид петель, которые окрашены менее интенсивно, чем двухцепочечные участки. Эти расплетенные участки ДНК богаты АТ-парами оснований. Один из них помечен стрелкой

Разделенные комплементарные цепи ДНК спонтанно реассоциируют с образованием двойной спирали, если температура становится ниже Т_пл. Этот процесс ренатурации иногда называют отжигом. Скорость реассоциации зависит от концентрации комплементарных последовательностей (разд. 29.10). Легкость, с которой плавятся и реассоциируют двойные спирали, имеет критическое значение для выполнения ДНК ее биологических функций.