БИОЛОГИЯ Том 1 - руководство по общей биологии - 2004

7. АВТОТРОФНОЕ ПИТАНИЕ

7.6. Биохимия фотосинтеза

7.6.3. Темновые реакции

Темновые реакции протекают в строме хлоропластов, не требуют света и контролируются ферментами. В результате этих реакций происходит восстановление диоксида углерода с использованием энергии (АТФ) и восстанавливающей способности (восстановленный НАДФ), произведенных в ходе световых реакций. Последовательность темновых реакций была определена в США Кальвином, Бенсоном и Бессемом в 1946—1953 годах. За эту работу в 1961 г. Кальвин был удостоен Нобелевской премии.

Опыты Кальвина

В своей работе Кальвин использовал изотоп углерода ¹⁴С (период полураспада 5570 лет, см. приложение 1), который стал доступен для исследователей только в 1945 г. Кроме того, Кальвин использовал бумажную хроматографию, которая в то время была относительно новым, но редко применяемым методом. Культуры одноклеточных зеленых водорослей Chlorella выращивали в популярном в настоящее время аппарате (рис. 7.15), по форме напоминающем леденец на палочке. Культуру хлореллы выдерживали с ¹⁴СO₂ в течение различных промежутков времени, а затем быстро убивали, помещая в горячий метанол. Растворимые продукты фотосинтеза экстрагировали, концентрировали и разделяли при помощи двумерной бумажной хроматографии (рис. 7.16 и приложение 1). Цель данного эксперимента состояла в том, чтобы проследить маршрут, по которому меченый углерод через ряд промежуточных соединений включается в конечный продукт фотосинтеза. Соединения на хроматограмме обнаруживали при помощи радиоавтографии. Для этого использовалась фотопленка, чувствительная к излучению ¹⁴СO₂. Фотопленку накладывали на хроматограмму и она темнела там, где находились радиоактивные соединения (рис. 7.16). Уже после 1 мин инкубации с ¹⁴СO₂ синтезировались многие сахара и органические кислоты, в том числе аминокислоты. Используя краткосрочные выдержки (в течение 5 с и менее), Кальвину удалось идентифицировать первый продукт фотосинтеза — кислоту, содержащую 3 атома углерода (3С-кислота) — фосфоглицериновую (ФГ). В дальнейшем исследователь определил всю последовательность промежуточных соединений, в которые включается меченый углерод (стадии этого процесса будут рассмотрены ниже). С тех пор последовательность этих реакций носит название цикл Кальвина.

Рис. 7.15. Схема, показывающая принцип устройства аппарата Кальвина типа «леденец на палочке». Он состоит из тонкого прозрачного сосуда, в котором выращивается культура одноклеточных водорослей. В экспериментах по определению пути, проходимому углеродом в процессе фотосинтеза, через суспензию водорослей продували диоксид углерода, содержащий радиоактивный углерод.

Рис. 7.16. Идентификация продуктов фотосинтеза в водорослях после короткого периода освещения в присутствии радиоактивного диоксида углерода ¹⁴СO₂. Для разделения продуктов используется бумажная хроматография. Расположение соединений на бумаге позволяет их идентифицировать. Присутствие синтезированных веществ на хроматограмме выявляли при помощи фотопленки. Она темнела там, где находились радиоактивные соединения.

7.4. Каковы преимущества использования долгоживущих радиоактивных изотопов в биологических экспериментах?

7.5. В чем преимущество использования хлореллы вместо цветковых растений?

7.6. Почему сосуд типа «леденец на палочке» имеет в сечении сплющенную, а не шарообразную форму?

Путь углерода

УЛАВЛИВАНИЕ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА (ФИКСАЦИЯ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА).

Акцептором диоксида углерода является 5С- сахар (пентоза), рибулозобисфосфат (РиБФ; рибулоза с двумя фосфатными группами). Присоединение диоксида углерода к любому соединению называется карбоксилированием, а участвующий в этом фермент — карбоксилазой. 6С-продукт нестабилен и мгновенно распадается на две молекулы фосфоглицерата (ФГ). Это — первый продукт фотосинтеза. В строме хлоропластов в больших количествах содержится фермент рибулозобисфосфаткарбоксилаза — фактически самый распространенный белок на Земле.

ВОССТАНОВИТЕЛЬНАЯ ФАЗА.

ФГ — это фосфоглицерат, 3С-кислота. В его состав входит кислотная карбоксильная группа (—СООН). ТФ — это триозофосфат (глицеральдегидфосфат), 3С-сахар. В его состав входит альдегидная группа (—СНО).

Восстановительная способность восстановленного НАДФ и энергия АТФ используются для удаления кислорода из ФГ (восстановление). Реакция протекает в две стадии: на первой используется некоторое количество АТФ, произведенного в световых реакциях, а на второй — весь восстановленный НАДФ, полученный в этих реакциях. Суммарный итог — восстановление карбоксильной кислотной группы (—СООН) до альдегидной (—СНО). Продукт представляет собой ЗС-фосфат сахара (триозофосфат), т. е. сахар с присоединенной фосфатной группой. Это соединение обладает большей химической энергией и является первым углеводом, образованным в процесс фотосинтеза.

РЕГЕНЕРАЦИЯ АКЦЕПТОРА ДИОКСИДА УГЛЕРОДА РиБФ. Некоторые из триозофосфатов (ТФ) должны использоваться для регенерации рибулозобисфосфата, потребленного в ходе первой реакции. Этот процесс представляет собой сложный цикл с участием 3С-, 4С-, 5С-, 6С- и 7С-фосфатов сахаров. Именно здесь используется оставшийся АТФ. На рис. 7.17 суммированы темно- вые реакции. На рисунке цикл Кальвина представлен в виде «черного ящика», в который подаются диоксид углерода и вода и из которого выходит ТФ. На схеме показано, что оставшийся АТФ используется для превращения рибулозофосфата (РиФ) в рибулозобисфосфат (РиБФ), однако все детали этого сложного процесса не показаны.

Рис. 7.17. Суммарная схема темповых реакций фотосинтеза (цикла Кальвина). РиБФ — рибулозобисфосфат; РиФ — рибулозофосфат; ФГ — 3-фосфоглицерат, ТФ — триозофосфат. Отметьте, что 10 хТФ используется для получения 6хРиФ (фосфата 5С-сахара рибулозы). ТФ состоит из 3 атомов углерода. Поэтому 10хТФ содержат 30 атомов углерода. 6хРиФ также содержат 30 атомов углерода (6х5С).

Суммарное уравнение для темновых реакций имеет вид:

Важно отметить, что шесть молекул диоксида углерода идет на получение двух молекул 3С-сахара (триозофосфата). Если коэффициенты предыдущего выражения разделить на шесть, выражение можно упростить:

7.7. Перерисуйте рис. 7.17, показав только число атомов углерода, вовлеченных в реакции, например 6РиБФ = 6 х 5С.