БИОЛОГИЯ Том 1 - руководство по общей биологии - 2004
4. ФЕРМЕНТЫ
4.3. Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций
4.3.5. Лабораторные работы
Опыт 4.1. Изучение влияния концентрации фермента на гидролиз сахарозы, катализируемый сахаразой (инвертазой)
Материалы и оборудование
2%-ный раствор сахарозы
1-, 0,75- и 0,5%-ный растворы сахаразы (инвертазы)
Реактив Бенедикта
12 пробирок со штативом
Водяные бани с температурой 38 и 100°С
Стеклянные палочки
Таймер
Дистиллированная вода
Этикетки
Бунзеновская горелка
Методика
1. Добавьте 2 мл прозрачного синего реактива Бенедикта к 2 мл прозрачного бесцветного 1%-ного раствора сахаразы. Нагрейте смесь на водяной бане при 100 °С в течение 5 мин (реакция Бенедикта).
2. Повторите процедуру 1 с 2 мл прозрачного бесцветного 2%-ного раствора сахарозы, а затем с 2 мл дистиллированной воды.
3. 5 мл 1%-ного раствора сахаразы доведите до кипения.
4. В восемь чистых сухих пробирок с этикетками 1—8 налейте по 1 мл реактива Бенедикта.
5. Имейте 5 мл 2%-ного раствора сахарозы в пробирку с этикеткой S и поместите на водяную баню, в которой на протяжении всего эксперимента поддерживается температура 38 °С.
6. Налейте 5 мл 1%-ного раствора сахаразы в пробирку с этикеткой Е и поместите ее в водяную баню с температурой 38 °С.
7. Выдержите обе пробки вместе с их содержимым в водяной бане в течение 5 мин для того, чтобы они приобрели нужную температуру.
8. Добавьте раствор фермента к раствору сахарозы и переверните пробирку, чтобы хорошо перемешать эти два раствора.
9. Сразу же включите отсчет времени и вновь поставьте пробирку, содержащую реакционную смесь, в водяную баню.
10. В течение всего опыта непрерывно перемешивайте реакционную смесь.
11. После 30 с инкубации перенесите 1 мл смеси в пробирку 1.
12. С интервалом в 30 с отберите такие же пробы и перенесите их по очереди в пробирки 2—8.
13. Нагрейте пробирки 1—8 в водяной бане с температурой 100 °С в течение 5 мин. Отметьте время первого появления кирпично-красного осадка, свидетельствующего о положительной реакции на редуцирующий сахар.
14. Повторите тот же эксперимент, использовав на этот раз прокипяченый раствор фермента (см. п. 3).
15. Повторите всю последовательность процедур дважды: с 0,75%-ным и 0,5%-ным растворами сахаразы.
16. Запишите ваши наблюдения и объясните полученные результаты.
Опыт 4.2. Изучение распределения каталазы в намоченных семенах гороха и влияния температуры на активность этого фермента
Каталаза — это фермент, катализирующий разложение пероксида водорода с образованием молекулярного кислорода, выделяющегося в виде пузырьков газа:
Пероксид водорода образуется в некоторых растительных и животных клетках в качестве побочного продукта метаболизма. Соединение это токсично для клеток, и каталаза обеспечивает эффективное его удаление. Каталаза — один из наиболее быстро работающих ферментов.
Материалы и оборудование
Горсть намоченного гороха
Раствор пероксида водорода
Пробирки со штативом
Водяные бани с температурой 40, 50, 60, 70, 80 и 100 °С
Часы
Термометр
Скальпели, ножницы и пинцеты
Держатель для пробирок
Стеклянная палочка
Белая кафельная плитка
Методика
1. Убедитесь в наличии каталазы. Для этого разомните одну горошину и нанесите на нее несколько капель пероксида водорода.
2. Снимите с трех горошин кожуру и проверьте в каталазу по отдельности кожуру и семядоли.
3. Поставьте две пробирки с дистиллированной водой в водяную баню с температурой 40 °С.
4. Прокипятите в отдельной пробирке три целые горошины, а затем поместите их в одну из пробирок на водяной бане.
5. В другую пробирку в водяной бане положите три горошины, не подвергавшиеся кипячению.
6. Выдержите пробирки в водяной бане в течение времени, достаточного для того, чтобы они приняли ее температуру (около 10 мин).
7. Проверьте каждую из горошин на каталазную активность.
8. Повторите тот же эксперимент при 50, 60, 70, 80 и 100 °С.
9. Запишите ваши наблюдения и объясните полученные результаты.
Опыт 4.3. Изучение влияния различных значений pH на активность фермента
Материалы и оборудование
Реактив Бенедикта
Буферные растворы с pH 3, 5, 7, 9 и 11
1%-ный раствор крахмала
Водяная баня с температурой 38 °С
Бунзеновская горелка
Асбест
Держатель для пробирок, штатив с пробирками
Градуированные пипетки на 5 мл
Термометр
Таймер
Дистиллированная вода
Исходный раствор амилазы (такой, какая содержится в слюне)
Методика
1. Сполосните рот 5 мл дистиллированной воды и выплюньте эту воду.
2. Наберите в рот 10 мл дистиллированной воды, пополощите в течение 1 мин и эту жидкость соберите.
3. Доведите объем этого раствора амилазы слюны до 40 мл дистиллированной водой.
4. Проверьте растворы амилазы, крахмала и буферные растворы на присутствие в них редуцирующих сахаров с помощью реактива Бенедикта.
5. Пометьте этикеткой «pH 3» одну из пробирок и внесите в нее 2 мл раствора крахмала.
6. Добавьте в ту же пробирку 2 мл буферного раствора с pH 3 и тщательно перемешайте оба раствора.
7. Прокипятите не менее 4 мл раствора фермента и влейте 4 мл этого раствора в пробирку с соответствующей этикеткой.
8. В другую пробирку, также снабженную этикеткой, влейте 4 мл раствора фермента, не подвергавшегося кипячению; поставьте все три пробирки в водяную баню и выждите некоторое время (около 1 мин) для того, чтобы они успели нагреться до 38 «С.
9. Влейте небольшое количество реактива Бенедикта в каждую из 11 пробирок и пометьте их цифрами 1—11. Следующие три этапа должны быть проведены очень быстро.
10. Когда растворы в водяной бане примут ее температуру, влейте забуференный раствор крахмала в некипяченый раствор фермента.
11. Хорошо перемешайте оба раствора, переворачивая пробирку, а затем снова поставьте пробирку в водяную баню.
12. Включите отсчет времени и сразу же перенесите небольшое количество реакционной смеси (примерно равное по объему взятому реактиву Бенедикта) в пробирку 1.
13. На протяжении всего опыта энергично встряхивайте смесь.
14. По истечении 1 мин перенесите в пробирку 2 вторую порцию реакционной смеси (приблизительно того же объема, что и первая).
15. Повторяйте ту же процедуру с интервалами 1 мин в течение еще 9 мин (т. е. заполните отобранными пробами пробирки 3-11).
16. Отметьте для пробирок 1—11 продолжительность инкубации, требуемой для появления первых признаков положительной реакции Бенедикта (выпадения кирпично-красного осадка).
17. Повторите тот же опыт с прокипяченым раствором фермента, начиная от п. 7.
18. Повторите весь опыт целиком с каждым из остальных буферных растворов.
19. Постройте график зависимости времени гидролиза от pH и объясните полученные результаты.