БИОЛОГИЯ Том 2 - руководство по общей биологии - 2004
12. МИКРОБИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
12.9. Лабораторная работа
12.9.2. Бактериологические опыты
Три описанных ниже опыта, в каждом из которых используются приемы асептики, предназначены для того, чтобы овладеть навыками по использованию микробиологических методик. Первый опыт — выращивание культуры молочных бактерий — включает приготовление чашек с агаром и посев бактерий штрихом. Второй — окрашивание по Граму бактерий из опыта 12.1 для их изучения с помощью светового микроскопа. Третий включает подсчет бактериальных колоний с использованием метода серийных разведений.
Опыт 12.1. Изучение содержания бактерий в свежем и несвежем молоке
Цель опыта — установить, как влияет суточное хранение молока при комнатной температуре на его качество и выяснить, почему молоко скисает. Молоко — практически полноценная пища для людей, а предлагаемые опыты показывают, что молоко служит хорошей питательной средой и для целого ряда бактерий.
Материалы и оборудование
Четыре стерильные чашки Петри с питательным агаром
Микробиологическая петля
Бунзеновская горелка
Несмываемый маркер или восковой карандаш
Свежее пастеризованное молоко
Несвежее молоко (молоко, простоявшее 24 ч при комнатной температуре)
Термостат на 35 °С
Методика
1. Простерилизуйте петлю в пламени бунзеновской горелки (подержите ее там, пока она не раскалится докрасна) (рис. 12.4).
2. Остудите петлю и затем погрузите ее в пробу свежего молока, предварительно хорошо взболтав его.
3. Свободной рукой слегка приподнимите крышку стерильной чашки с агаром и легким движением распределите содержимое петли по поверхности агара, как показано на рис. 12.4.
4. Закройте крышку и снова прокалите петлю в пламени горелки.
5. Подпишите донышко чашки несмываемым маркером (или восковым карандашом).
6. Повторите всю процедуру со второй чашкой и другой пробой свежего молока.
7. Снова прокалите петлю и, остудив ее, погрузите в пробу несвежего молока.
8. Распределите содержимое петли по поверхности третьей чашки и закройте крышку.
9. Подпишите донышко чашки несмываемым маркером.
10. Повторите то же самое с четвертой чашкой и второй пробой несвежего молока.
11. Поместите все чашки в термостат и инкубируйте при 35 °С примерно три дня. Прежде чем ставить чашки в термостат, переверните их вверх дном, чтобы капли конденсата не капали сверху на культуру. После инкубации склейте две половинки каждой чашки липкой лентой, чтобы культура не пропала.
12. Опишете внешний вид колоний и сравните ваши результаты с описанием из разд. 12.9.1.
Примечания
1. Студенты могут залить чашки самостоятельно, если есть стерильные флаконы Маккартни с расплавленным агаром.
2. При посеве штрихом число бактерий в каждом последующем штрихе постепенно уменьшается. Этот метод удобнее использовать, когда число бактерий в пробе велико, как, например, в молоке. Обычно его используют для выделения чистых колоний бактерий из смешанной культуры.
3. После инкубации чашки можно поместить в холодильник и хранить там, пока они не потребуются. Охлаждение препятствует дальнейшему росту бактерий.
4. Когда чашки станут больше не нужны, их следует поместить в пакет для одноразового использования, проавтоклавировать 15 мин и только потом выбросить.
5. С молоком можно провести и другие опыты. Опыт, описанный выше, самый простой. Можно изучить влияние охлаждения. Кроме того, если нетрудно получить пробы сырого (непастеризованного) молока (например, прямо с молочной фермы), можно изучить влияние процесса пастеризации на содержание бактерий в молоке. Для пастеризации сырое молоко разливают в стерильные пробирки, затыкают пробирки ватными пробками, а затем прогревают в течение 35 мин при 63 °С на водяной бане. Третий вариант опыта — инкубировать некоторые чашки при 10 °С, а не при 35 °С. Такая низкая температура благоприятна для роста Streptococcus lactis и не способствует росту Lactobacillus.
Опыт 12.2. Окрашивание бактерий для изучения их с помощью светового микроскопа
С помощью фазово-контрастного микроскопа можно изучать живые бактерии, однако чаще клетки все же предварительно фиксируют и окрашивают.
Одним из методов окрашивания, который важен для идентификации бактерий, является окрашивание по Граму. До окрашивания бактерии бесцветны. После окрашивания грамположительныебактерии становятся фиолетовыми, а грамотрицательные — красными. Различие между двумя типами бактерий описано в разд. 2.3.1 (клеточная стенка).
Материалы и оборудование
Основной краситель — крастиллический фиолетовый (0,5%-ный водный раствор)
Протрава — раствор Люголя
Ацетон—спирт (50:50 ацетон:абсолютный спирт) для обесцвечивания
Дополнительный краситель — сафранин (1%-ный водный раствор)
Проволочная петля Бунзеновская горелка
Тщательно вымытые предметные стекла (протертые спиртом)
Пинцет
Штатив для окрашивания, помещенный над кюветой или чашкой
Промывалка с дистиллированной водой
Фильтровальная бумага
Иммерсионное масло и микроскоп с иммерсионным объективом
Методика
(Этапы 1—6 должны занимать не более 5 мин) (Из кн.: Bacteriology, J. Humphries, John Murray, 1974.)
1. Приготовьте мазок бактерий на предметном стекле. Для этого прокалите проволочную петлю в пламени горелки и охладите ее. Капните 1—2 капли воды в центр чистого стекла. Слегка коснитесь проволочной петлей выбранной вами бактериальной колонии, полученной в предыдущем эксперименте; чашку приоткрывайте как можно меньше, чтобы не загрязнить культуру. Перенесите клетки на предметное стекло и осторожно перемешайте петлей. Размажьте клетки по предметному стеклу в виде тонкой пленки, чтобы получилось пятно площадью 3 х 1 см. Снова прокалите петлю. Очень важно добиться нужной толщины мазка. Он должен чуть- чуть опалесцировать и чаще получается слишком толстым, а не слишком тонким. Толщина мазка должна быть одинакова по всей поверхности. Дайте мазку полностью высохнуть на воздухе (несколько минут).
2. Зафиксируйте бактерии. Возьмите предметное стекло пинцетом и в горизонтальном положении проведите его три раза через желтую часть пламени бунзеновской горелки. Важно не перегреть стекло. Проверьте правильность нагрева следующим образом: после каждого проведения через пламя слегка коснитесь стеклом руки. Если оно не слишком горячее, то все делается правильно. При фиксации бактериальные клетки гибнут в результате коагуляции цитоплазмы и прилипают к стеклу.
3. Окрашивание бактерий. При окрашивании очень легко запачкать поверхность стола, поэтому процедуру лучше проводить на штативе, размещенном над кюветой или кристаллизатором. Штатив можно сделать из двух стеклянных или металлических палочек, положив их строго горизонтально на края кюветы или кристаллизатора на расстоянии 5 см друг от друга. Закрепите палочки пластилином. Залейте стекло раствором кристаллического фиолетового и оставьте на 30 с. Все бактерии окрасятся в фиолетовый цвет.
4. Смойте краситель раствором Люголя; для этого залейте стекло этим раствором и оставьте на 30 с. Смойте йод дистиллированной водой из промывалки. Йод более прочно связывает краситель внутри клеток.
5. Промывайте стекло смесью ацетон- спирт до тех пор, пока не перестанет отходить краситель (примерно 3 с); после этого немедленно промойте стекло водой, чтобы препарат совсем не обесцветился. Если нужно, повторите эту процедуру (умение определять продолжительность отмывки приходит только с опытом). После отмывки обесцвечиваются грамотрицательные бактерии. Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми.
6. Залейте стекло сафранином и оставьте на 1 мин. Отмойте краситель водой. Осторожно просушите стекло между слоями чистой фильтровальной бумаги и дайте ему окончательно высохнуть на воздухе. Сафранин является дополнительным красителем. Он применяется после кристаллического фиолетового и окрашивает все грамотрицательные бактерии в красный цвет.
7. Нанесите на мазок каплю иммерсионного масла и рассмотрите препарат под иммерсионным объективом (разд. 5.11.2).
Результаты
Согласуются ли ваши наблюдения с тем, что написано в разд. 12.9.1 о содержании бактерий в молоке?
Опыт 12.3. Сравнение численности бактерий в свежем и несвежем молоке
Если одиночную бактерию поместить на питательный агар, она начнет делиться и образует колонию, которая в отличие от исходной клетки видна невооруженным глазом. Это свойство можно использовать для подсчета бактерий.
Простерилизуйте оборудование. Первая часть опыта основана на использовании метода серийных разведений. Число бактерий в молоке огромно, поэтому для подсчета удобнее взять пробу небольшого объема и развести ее в известное число раз. Приготовьте серии разведений. Во второй части опыта из каждого разведения отберите пробу для посева. Для подсчета числа бактерий в определенном объеме молока (т. е. титра) используйте ту чашку, на которой после инкубации выросло наиболее подходящее число колоний (достаточно большое, но без перекрывания колоний).
Материалы и оборудование
Шесть стерильных чашек с питательным агаром
Восемь градуированных пипеток на 1 см3
Градуированная пипетка на 10 см3
Шесть пробирок и штатив для них
Хлопковая вата
Печь на 160 °С
Несмываемый маркер
Бунзеновская горелка
100 см3 дистиллированной воды
Свежее молоко
Несвежее молоко
70%-ный спирт
Алюминиевая фольга
Стеклянный шпатель
Стерилизация оборудования
1. Закройте каждую из шести пробирок ватной пробкой; пробки плотно оберните алюминиевой фольгой.
2. В кончик каждой из восьми пипеток на 1 см3 и одной пипетки на 10 см3 поместите небольшой комочек ваты и заверните каждую пипетку отдельно в алюминиевую фольгу.
3. Положите пробки и пипетки в горячую суховоздушную печь, нагретую до 160 °С, и оставьте их там на 60 мин (колбы со средой и водой в такой печи стерилизовать нельзя).
4. Перед использованием дайте оборудованию остыть.
Серийное разведение молока и посев клеток на чашки с агаром
1. Подпишите шесть стерильных, закрытых пробками пробирок, пометив их C1, С2, С3, HI, Н2 и Н3. Снимите с пробок алюминиевую фольгу.
2. Подпишите донышки шести стерильных чашек с питательным агаром C1, С2, С3, HI, Н2 и Н3.
3. Внесите в каждую из шести пробирок по 9,9 см3 стерильной дистиллированной воды. Для этого воспользуйтесь следующими приемами.
а) Мизинцем и безымянным пальцем одной руки выньте ватную пробку из колбы со стерильной дистиллированной водой.
б) Держа пробку одной рукой, другой рукой возьмите стерильную пипетку на 10 см3 и наберите из колбы 9,9 см3 стерильной дистиллированной воды.
в) Закройте колбу пробкой.
г) Точно таким же способом, как в пункте а, выньте пробку из первой пробирки.
д) Перенесите 9,9 см3 воды в эту пробирку.
е) Закройте пробку.
ж) То же самое проделайте с остальными пятью пробирками.
4. Хорошо встряхните пробу свежего молока и, взяв стерильную пипетку на 1 см3, перенесите 0,1 см3 молока в пробирку С1. Пробку вынимают и помещают обратно так же, как и раньше. Получается разведение в 100 раз.
5. Мягко встряхните пробирку, чтобы хорошо перемешать содержимое.
6. Возьмите новую стерильную пипетку и перенесите 0,1 см3 из пробирки С1 в стерильную чашку, помеченную С1, лишь слегка приоткрывая крышку чашки.
7. Простерилизуйте стеклянный шпатель; для этого окуните его в 70%-ный спирт, дайте стечь избытку спирта и затем подержите шпатель вертикально в пламени бунзеновской горелки.
8. Дайте шпателю остыть и холодным шпателем разотрите пробу молока по поверхности чашки.
9. Снова простерилизуйте шпатель.
10. Используя ту же пипетку, что и в пункте 6, перенесите 0,1 см3 из пробирки С1 в пробирку С2, вынув и поместив ватную пробку на место, как указано выше.
11. Хорошо перемешайте пробу, встряхнув пробирку С2. Получается разведение в 10 000 раз.
12. Повторите операции, указанные в пунктах 10—11, используя С3 вместо С2. Это дает разведение в 1 000 000 раз. Повторите операции, указанные в пунктах 6—9, используя С3 вместо С1.
13. Повторите серийные разведения, используя в качестве проб несвежее молоко, и приготовьте чашки H1, Н2 и Н3.
14. Переверните приготовленные шесть чашек донышками вверх и поставьте примерно на 3 сут в термостат при 35 °С.
15. Скрепите крышки и донышки чашек липкой лентой, чтобы избежать возможного распространения патогенных микроорганизмов.
16. Оцените рост бактерий на чашках. Где удастся, подсчитайте число отдельных колоний. Запишите полученные результаты в виде таблицы и рассчитайте по ним число бактерий в 1 см3неразбавленного молока.
Примечания
Посмотрите примечания 3 и 4 в конце описания эксперимента 12.1.