ГЕНЕТИКА - Підручник - А.В. Сиволоб - 2008

РОЗДІЛ 9. Генетична інженерія і методи молекулярної генетики

МЕТОДИ ГЕННОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Основні ферменти генної інженерії

Головним інструментом для здійснення генно-інженерних операцій є природні ферменти, які каталізують реакції деградації та синтезу нуклеїнових кислот. Особливе місце серед них належить рестриктним ендонуклеазам (рестриктазам), що здійснюють специфічне розрізай-

ня молекули ДНК усередині певних елементів послідовності нуклеотидів. Рестриктази (існує кілька сотень таких ферментів) виконують у бактеріальних клітинах роль захисту від чужорідної ДНК бактеріофагів. Назви цих ферментів утворюються за таким принципом: перша велика літера позначає рід мікроорганізму, дві маленькі - вид, римські цифри та іноді великі літери - порядковий номер рестриктази серед інших рестриктаз даної бактерії. Наприклад, EcoRI - рестриктаза RI із Escherichia coli.

Послідовності нуклеотидів, які впізнаються рестриктазами, відрізняються великою різноманітністю: сайтом рестрикції є невеликі (4, 6, іноді трохи більше пар основ) паліндромні послідовності (такі, що читаються однаково в напрямку 5'-3' по обох ланцюгах, рис. 9.1). Залежно від типу рестриктази, два розрізи, які вона здійснює, можуть бути розташованими точно один напроти одного у двох ланцюгах, що зумовлює утворення так званих тупих кінців. Частіше рестриктази залишають взаємно комплементарні 5'-кінцеві (іноді З'-кінцеві) одно- ланцюгові вирости - липкі кінці (рис. 9.1).

Рис. 9.1. Приклади рестриктних сайтів (ліворуч, стрілками позначено місця розрізів) та продуктів рестрикції (праворуч).

Рестриктази BamHI та NotI залишають липкі кінці з 5'-кінцевими виступами,

PstI - із 3'-кінцевими виступами, HpaI - тупі кінці

Крім того, часто використовують різноманітні менш специфічні нуклеази - ферменти, що каталізують реакцію гідролізу нуклеїнових кислот. Нуклеази можуть діяти тільки на молекули ДНК (ДНКази) або РНК (РНКази); вибірково гідролізувати тільки одноланцюгову (нуклеаза S1) або дволанцюгову (екзонуклеаза ІІІ) молекулу ДНК; діяти тільки на гібридну молекулу РНК-ДНК (РНКаза Н) тощо.

Наступний важливий для генної інженерії фермент - ДНК-залежна ДНК-полімераза (див. розділ 1). Найчастіше використовують ДНК-полі- меразу І E. coli. Їй притаманні три види каталітичної активності:

✵ полімеразна, що зумовлює синтез ланцюга ДНК у напрямку 5'-3' на одноланцюговій ДНК-матриці у присутності чотирьох нуклеозидтрифосфатів і короткого ДНК-праймера, який має вільну З'-гідроксильну групу;

✵ З'-екзонуклеазна, яка спричиняє відщеплення нуклеотидів від 3'-кінця з метою редагування помилок;

✵ 5'-екзонуклеазна, що забезпечує відщеплення нуклеотидів від 5'-кінця полінуклеотидного ланцюга.

За рахунок першої та третьої активностей ДНК-полімераза І одночасно може каталізувати реакцію полімеризації та гідроліз нуклеотидного ланцюга в напрямку 5'-3', починаючи з одноланцюгового розриву у дво- ланцюговій ДНК. Такий процес називається нік-трансляцією: при цьому розрив (нік) переміщується вздовж ланцюга ДНК у напрямку 5'-3' на відстань до однієї тисячі пар нуклеотидів. Нік-трансляцію використовують, зокрема, для введення в ДНК радіоактивно мічених нуклеотидів.

Від ДНК-полімерази І за допомогою трипсину або субтилізину можна відокремити великий фрагмент (фрагмент Кленова), що зберігає тільки полімеразну та З'-екзонуклеазну активності. Відсутність 5'-екзонуклеазної активності дає змогу, зокрема, використовувати фрагмент Кленова для "заповнення" одноланцюгових 5'-кінцевих виступів, що утворюються при розрізанні ДНК рестриктазами.

Також використовують ДНК-полімеразу фага Т4. Їй притаманні ті самі активності, що й фрагменту Кленова, але її 3'-екзонуклеазна активність є у 200 разів вищою. Відповідно, цю полімеразу застосовують для введення мітки до рестриктів із виступами З'-кінців.

ДНК-лігаза являє собою ще один із найважливіших інструментів генної інженерії. Вона каталізує синтез фосфодіефірного зв'язку між 5'-фосфатним і 3'-гідроксильними кінцями в місці одноланцюгового розрізу (ніка) у дволанцюговій молекулі ДНК. Найчастіше використовують ДНК-лігазу фага Т4, яка здатна в присутності АТР зшивати фрагменти ДНК із липкими кінцями: два взаємно комплементарні липкі кінці утворюють подвійну спіраль з двома ніками (рис. 9.1), які зашиваються лігазою.

Для синтезу ДНК на РНК-матриці використовують РНК-залежну ДНК-полімеразу - зворотну транскриптазу. Назва ферменту пов'язана з тим, що він каталізує реакцію, зворотну першому етапу експресії гена - транскрипції, первинним продуктом реакції є гібрид

РНК-ДНК. У генній інженерії зазвичай використовують зворотну транскриптазу з РНК-вірусів птахів (див. розділ 5). Вона складається з двох субодиниць і має щонайменше дві активності: ДНК-полімеразну (може використовувати як матрицю одноланцюгові РНК або ДНК); активність РНКази Н (гідролізує РНК у складі гібрида РНК-ДНК, але не атакує вільну РНК). Таким чином, фермент синтезує на РНК- матриці комлементарну молекулу ДНК (кДНК).

Серед інших різноманітних ферментів, які використовують у генній інженерії, слід згадати термінальну дезоксинуклеотидилтрансферазу, яка може нарощувати нуклеотиди на 3'-кінець одноланцюгової молекули ДНК. З її допомогою можна "підтупити" кінці ДНК (якщо 3'-кінець є коротшим) або подовжити одноланцюгові 3'-кінцеві вирости (безматричний синтез ДНК - використовуються нуклеотиди, що наявні в реакційній суміші).