ГЕНЕТИКА - Підручник - А.В. Сиволоб - 2008

РОЗДІЛ 9. Генетична інженерія і методи молекулярної генетики

МЕТОДИ ГЕННОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Клонування ДНК

Методами клонування будь-які фрагменти ДНК, отримані за допомогою рестриктаз, можна вбудувати в плазміду або ДНК бактеріофага - вектор для молекулярного клонування, а потім розмножити ці генетичні елементи в клітинах бактерій або дріжджів, збільшуючи їхню кількість у мільйони разів.

Необхідність використання вектора зумовлена тим, що при звичайному введенні ДНК у клітини вона піддається дії нуклеаз, які розщеплюють її до нуклеотидів. Щоб ДНК стала складовою частиною генетичного апарату клітини, вона повинна або вбудуватися в її геном, або бути здатною до автономної реплікації.

Як вектор для клонування часто використовують бактеріальні плазміди (розділ 5). Основними вимогами до плазміди як вектора є наявність у її складі ориджина реплікації, унікального (одного на плазміду) сайта, що впізнається певною рестриктазою, і гена стійкості до одного з антибіотиків як селективного маркера (рис. 9.2). Із метою створення рекомбінантної ДНК очищену плазміду, яка містить єдиний сайт певної рестриктази, обробляють цією рестриктазою та отримують лінійний вектор з липкими кінцями. Далі додають фрагмент ДНК, який було вилучено за допомогою тієї самої рестриктази. За рахунок комплементарної взаємодії між липкими кінцями фрагмента й вектора утворюється циркулярний нековалентний комплекс двох молекул ДНК. Завдяки використання ДНК-лігази полінуклеотидні ланцюги зшиваються - утворюється рекомбінантна молекула ДНК. Найзручнішими є плазмідні вектори, котрі містять так званий полілінкер - ділянку з певним набором унікальних рестриктних сайтів, що дозволяє підібрати одну з рестриктаз, найбільш придатну для кожного випадку.

Рис. 9.2. Схема організації плазмідного вектора (Ori - ориджин реплікації, amp - ген стійкості до ампіциліну)

Фрагменти ДНК із тупими кінцями також можна вбудувати у вектор за допомогою лігази, хоча така реакція є на порядок менш ефективною. За допомогою термінальної трансферази до 3'-кінців фрагмента ДНК можна приєднати, наприклад, одноланцюговий poly(A)- хвіст, а до З'-кінців лінійного вектора - poly(T). При змішуванні між комплементарними одноланцюговими кінцями відбудеться спарювання, остаточне зшивання завершує ДНК-лігаза. Таким чином можна об'єднувати будь-які фрагменти з тупими кінцями, незалежно від методу їхнього отримання.

Ферментативним шляхом можна утворити тупі кінці на фрагментах із липкими кінцями. Для цього або здійснюють видалення одно- ланцюгових виростів за допомогою нуклеази S1, або липкі кінці забудовують за допомогою фрагмента Кленова. Утворений фрагмент із тупими кінцями вбудовують у вектор за вже описаним методом.

Трансформація бактеріальних клітин рекомбінантною плазмідою здійснюється зазвичай у розчині СаСІ₂ або шляхом електропорації (через суспензію клітин проводиться короткий імпульс електричного струму). В обох випадках підвищується проникність клітинної стінки й рекомбінантна плазміда потрапляє всередину. Далеко не всі бактерії отримують плазміду при трансформації, і тут стає в пригоді ген стійкості до антибіотика: достатньо обробити бактеріальну культуру цим антибіотиком, щоб залишити тільки трансформовані клітини. Далі відбувається автономна реплікація плазміди й розмноження самих клітин, що приводить до значного зростання загальної кількості плазмід (рис. 9.3). Клоновані плазміди виділяють із бактеріальної культури, а обробка їх тією самою рестриктазою, що була використана при виготовленні рекомбінантної молекули, дозволяє вирізати з вектора клонований фрагмент ДНК.

Найпоширенішими плазмідними векторами сьогодні є штучні плазміди - похідні від плазміди pUC (pBluescript, pGEM). Це невеликі (~2,7 тис. пар основ) мультикопійні плазміди, що містять ген стійкості до антибіотику, ориджин і полілінкер, вбудований у ген lacZ. Полілінкер сам по собі не впливає на експресію цього гена, продуктом якої є фермент, який перетворює певний синтетичний субстрат на сполуку синього кольору. Якщо фрагмент ДНК вбудовується в полілінкер, це порушує експресію гена lacZ, і можна легко відбирати тільки ті клони бактерій, котрі містять рекомбінантну ДНК.

Рис. 9.3. Розмноження рекомбінантної плазміди в бактеріальних клітинах

Чим менша плазміда за розміром, тим вона стабільніша, а отже, і трансформація бактерій плазмідами є ефективнішою. Відповідно, існує обмеження в розмірі фрагментів, що їх можна клонувати описаним шляхом - до 10 тис. пар основ. Альтернативною, але цілком аналогічною технікою, що дозволяє працювати з фрагментами довжиною приблизно 20 тис. пар основ, є клонування ДНК із використання векторів на основі бактеріофага X (див. розділ 5). За допомогою рестриктази фрагмент ДНК вбудовується у фагову ДНК, додаються порожні фагові оболонки, і здійснюється збірка фагових частинок in vitro. Рекомбінантними бактеріофагами заражають бактеріальну культуру, де відбувається їхнє розмноження.

Використовуючи вектори на основі космід, можна клонувати фрагменти ДНК до 40 тис. пар основ. Косміда є плазмідою, яка крім ориджину, сайтів рестрикції та генів стійкості до антибіотиків містить два так звані cos-сайти: липкі кінці лінійної молекули ДНК бактеріофага X. Саме за рахунок cos-сайтів лінійна молекула фагової ДНК циркуляризується після її проникнення в бактеріальну клітину. У лінійну косміду з такими липкими кінцями вбудовується фрагмент ДНК, який бажано клонувати. Рекомбінантна косміда упаковується invitro у фагові частинки, якими обробляють бактеріальну культуру. У цьому випадку бактеріофаг використовується як ефективний засіб трансформації: лінійна косміда проникає в клітину, де за рахунок cos-сайтів і бактеріальної лігази циркуляризується. Далі циркулярна косміда розмножується, як звичайна плазміда за схемою на рис. 9.3.

Для клонування фрагментів ДНК від 100 тис. пар основ розроблені спеціально сконструйовані вектори ВАС і YAC. BAC-вектори створено на основі F-плазмід бактерій (розділ 5). YAC-вектор являє собою штучну дріжджову мініхромосому, яка містить центромеру, теломери і точку початку реплікації. У такий вектор можна ввести чужорідний фрагмент ДНК розміром понад 100 тис. пар основ, і така мініхромосома, уведена в дріжджову клітину, буде реплікуватись і поводити себе аналогічно до інших дріжджових хромосом при мітотичному поділі.

Більшість сучасних векторних систем поліфункціональні, тобто придатні не тільки для клонування ДНК, а й для експресії рекомбінантних білків.