ГЕНЕТИКА - Підручник - А.В. Сиволоб - 2008
РОЗДІЛ 9. Генетична інженерія і методи молекулярної генетики
МЕТОДИ ГЕННОЇ ІНЖЕНЕРІЇ
Геномні бібліотеки
Розглянуті принципи клонування фрагмента ДНК залишають питання, звідки береться той чи інший фрагмент ДНК. Для того, щоб працювати з певною ділянкою ДНК (наприклад, певним геном) спочатку здійснюють клонування великої кількості різноманітних фрагментів геному - створюють бібліотеку клонів, серед яких уже шукають потрібний.
Стандартна процедура створення бібліотеки - метод дробовика (shotgun) - розпочинається з часткової (протягом обмеженого часу) обробки всієї геномної ДНК певною рестриктазою - так, щоб отримати набір різноманітних фрагментів, що перекриваються, певної середньої довжини (рис. 9.4). Усі такі фрагменти вбудовуються у вектори, після чого здійснюється трансформація. Бактерії висіваються на твер-
де середовище таким чином, що кожна колонія веде походження від однієї клітини. Отже, набір колоній - це набір різноманітних клонів, кожен з яких містить один із фрагментів геному.
Аналогічно до геномних бібліотек створюють бібліотеки клонів кДНК. Для цього спочатку виділяють сумарну мРНК із клітин певного типу. Використовуючи зворотну транскриптазу та oligoT, що комплементарні до З'-кінцевих polyA-хвостів мРНК, як праймери, на цих мРНК синтезують комплементарні ланцюги ДНК. Далі отримані молекули кДНК піддають клонуванню. На відміну від геномної, бібліотека клонів кДНК містить тільки кодуючі послідовності (екзони) генів і тільки таких генів, які є активними в клітинах даного типу.
Рис. 9.4. Метод дробовика
Потрібну нуклеотидну послідовність серед бібліотеки клонів можна знайти за допомогою гібридизації клонованої ДНК із радіоактивно міченим ДНК-зондом (рис. 9.5). Колонії бактерій у чашці Петрі переносять на нітроцелюлозний фільтр - роблять своєрідну репліку. Потім здійснюють лізис клітин, депротеїнізацію та денатурацію ДНК у лужному розчині. Після висушування фільтра одноланцюгову ДНК необернено фіксують на ньому. Фільтр обробляють радіоактивно міченою ДНК певної послідовності - зондом. Якщо зонд комплементарний ДНК клона, відбувається гібридизація - ренатурація дволанцюгової ДНК. Детектування цього факту за допомогою авторадіографії дозволяє ідентифікувати розшукуваний клон.
Синтез зонда найчастіше проводять, використовуючи базу даних EST (Expressed Sequence Tag). База є загально доступною колекцією великої кількості коротких (200-400 пар основ) фрагментів послідовностей кДНК багатьох організмів. Достатньо знайти в EST-базі коротку ділянку, що відповідає фрагменту послідовності білка (ген якого розшукується), і синтезувати її, щоб приготувати зонд.
Рис. 9.5. Гібридизація клонованої ДНК із радіоактивним зондом на нітроцелюлозному фільтрі
Секвенування (див. нижче) кожного з фрагментів, які містяться в геномній бібліотеці клонів, і порівняння послідовностей фрагментів, що перекриваються (рис. 9.4), дозволяє розмістити клоновані фрагменти в порядку їхньої локалізації в геномі, тобто встановити повну послідовність геному.
Велика кількість послідовностей (у тому числі повних послідовностей геномів), які вже встановлені й продовжують накопичуватись, створює завдання їхнього збереження та аналізу. Зрозуміло, що таке завдання (яке постає вже при порівнянні послідовностей окремих клонованих фрагментів із метою з'ясувати нуклеотидну послідовність геному) може бути виконаним лише за допомогою комп'ютерів. Біоінформатика - галузь, пов'язана з вирішенням зазначених проблем, сьогодні є невід'ємною складовою частиною генетики. Найбільші загальнодоступні через інтернет бази даних нуклеотидних і амінокислотних послідовностей створено в Європейській Лабораторії Молекулярної Біології (EMBLSequence Data Base) і Національних Інститутах Здоров'я США (GenBank). На відповідних порталах розміщено також програмні засоби порівняння послідовностей, пошуку промоторів, стартових точок транскрипції, інтронів і екзонів, визначення білкових послідовностей із послідовностей нуклеотидів тощо. На основі біоінформатичного аналізу можна встановити, наприклад, функціональне значення невідомого щойно клонованого гена по його гомології з відомим геном іншого організму, структуру гена (знайти промотор, екзони, точки термінації транскрипції), структурно-функціональні особливості нових білків, функціональні зв'язки між різними білками й генами, філогенетичні стосунки між різними таксонами. Завдяки розвитку біоінформатики з'явилась можливість, у доповнення до результатів, що отримують in vivo та in vitro, вирішувати різноманітні проблеми просто за допомогою комп'ютера - in silico.