ГЕНЕТИКА - Підручник - А.В. Сиволоб - 2008

РОЗДІЛ 9. Генетична інженерія і методи молекулярної генетики

МЕТОДИ ГЕННОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Полімеразна ланцюгова реакція

Альтернативним і додатковим до клонування методом збільшення кількості бажаного фрагмента ДНК - ампліфікації - є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, або PCR - Polymerase Chain Reaction). ПЛР - це реакція синтезу ДНК in vitro, яка повторюється багато разів: синтезовані ланцюги стають матрицями для синтезу в наступному циклі реакції. Для здійснення ПЛР треба знати принаймні короткі послідовності ДНК на кінцях того фрагмента, що має бути ампліфікований.

Реакційна суміш містить слідову кількість вихідної ДНК, надлишкові кількості двох синтетичних праймерів до кінців фрагмента, нуклеозидтрифосфати чотирьох типів і ДНК-полімеразу Taq термофільної бактерії Thermus aquaticus. Використання саме полімерази Taq викликано тим, що вона не втрачає своєї активності при нагріванні до високих температур. У кожному циклі реакції відбувається нагрівання суміші до 95 °С (денатурація ДНК) і охолодження до 60 °С. Після охолодження до такої все ще досить високої температури ланцюги ДНК не ренатурують, але праймери (оскільки вони присутні в досить високих концентраціях) знаходять свої комплементарні ділянки, зв'язуються з ними, і полімераза Taq починає працювати, подовжуючи ці праймери.

Метод ПЛР має надзвичайно широке застосування. Ним послуговуються кожного разу, коли є необхідність детектувати й дослідити невелику кількість ДНК, у тому числі - у складі неочищеного біологічного матеріалу. ПЛР застосовують також у комбінації з клонуванням: ампліфікований ДНК-продукт можна клонувати й використати, наприклад, для експресії білка (див. нижче); ампліфікація за допомогою ПЛР стає в пригоді для збільшення невеликої кількості клонованої ДНК.