ГЕНЕТИКА - Підручник - А.В. Сиволоб - 2008

РОЗДІЛ 9. Генетична інженерія і методи молекулярної генетики

ЕКСПРЕСІЯ РЕКОМБІНАНТНИХ БІЛКІВ

Методи генної інженерії дозволяють не тільки здійснювати різноманітні операції з нуклеїновими кислотами, а й отримувати практично будь-які білки у великих кількостях. Ген, що кодує даний білок, можна клонувати, вбудувати (наприклад, у бактеріальну плазміду) і змусити бактеріальну культуру продукувати цей білок. Виділення та очищення білка з культури біохімічними методами не є принциповою проблемою, зважаючи на його велику кількість.

Одну з найпростіших схем експресії білка в E. coli зображено на рис. 9.9. Зрозуміло, що еукаріотичний ген не має сенсу вводити у прокаріотичну клітину - прокаріоти не мають системи сплайсингу. Тому беруть лише кодуючу частину гена, яку можна отримати з бібліотеки клонів кДНК. Використовуючи придатну рестриктазу та лігазу, потрібну кДНК вбудовують у плазмідний вектор для експресії поряд із промотором - наприклад, лактозного оперона (див. розділ 2). Здійснюють трансформацію рекомбінантної плазміди в бактеріальні клітини, до бактеріальної культури додають синтетичний індуктор lac-оперона IPTG. Промотор активується, після чого здійснюється транскрипція гена та трансляція білка.

Більш ефективна двоступенева система експресії використовує промотор РНК-полімерази бактеріофага Т7. У бактеріальному геномі ані таких полімераз, ані відповідних промоторів немає. У клітину вводяться два плазмідні вектори: один містить Zac-промотор і ген РНК-полімерази Т7, інший - сильний промотор полімерази Т7 разом із геном білка, що має бути експресований. IPTG індукує експресію полімерази, яка зв'язується тільки з промотором у складі другої плазміди (інших промоторів немає) і забезпечує синтез великої кількості білка.

Рис. 9.9. Експресія білка в бактеріальній клітині. iac-Промотор - промотор лактозного оперона, IPTG - синтетичний індуктор iac-оперона

Велика кількість білків, у тому числі ферменти, що використовуються у рекомбінантних технологіях, виробляються сьогодні шляхом експресії в бактеріальних клітинах. Поряд із прокаріотичними розробляються та використовуються також системи експресії рекомбінантних білків в еукаріотичних клітинах. Особливо важливими еукаріотичні системи експресії є для еукаріотичних білків, що не можуть бути синтезовані бактеріальною клітиною в активній формі. Зокрема, це стосується білків, що піддаються суттєвим посттрансляційним модифікаціям - наприклад, глікопротеїдів. Найпростішим для використання еукаріотичним "біореактором" є дріжджі, маніпулювати якими так само легко й так само дешево, як і бактеріями. Як дріжджові експресуючі вектори використовують плазміди або штучні хромосоми YAC.

Рис. 9.10. Інтеграція гена у хромосомну ДНК

Крім того, часто буває доцільним вбудовування гена-мішені, що кодує бажаний білок, у хромосому клітини-хазяїна: клітина позбавляється при цьому зайвих витрат на реплікацію плазміди та синтез зайвих білків, гени яких несе плазміда. Здійснити інтеграцію можна за рахунок гомологічної рекомбінації між геномною ДНК і ділянками, що фланкують ген-мішень у плазміді (рис. 9.10).