ГЕНЕТИКА - Підручник - А.В. Сиволоб - 2008
РОЗДІЛ 2. Експресія генів
ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ У ПРОКАРІОТІВ
Транскрипція
Зростання ланцюга РНК при транскрипції відбувається в напрямі від 5'- до 3'-кінця. Субстратами реакції є 3'-кінцева ОН-група рибози зростаючого транскрипту (ланцюга РНК, що синтезується) і рибонук- леозидтрифосфати (rNTP). Принципова схема реакції ідентична схемі реакції синтезу ДНК (рис. 1.16) - приєднання чергового нуклеотиду залежить від його комплементарних взаємодій з тим ланцюгом ДНК, котрий використовується як матриця. Фермент, який каталізує цю реакцію - ДНК-залежна РНК-полімераза.
До складу бактеріальної РНК-полімерази входять кілька білкових субодиниць. Залежно від стадії транскрипції існує дві 'її форми:
1) кор-фермент у складі субодиниць, позначуваних як α (дві копії), β, β' і ω;
2) голофермент - комплекс кор-ферменту із субодиницею σ.
Кор-фермент може працювати на різноманітних послідовностях, оскільки має досить високу неспецифічну спорідненість до ДНК. Поява субодиниці о у складі голоферменту зумовлює зниження загальної неспецифічної спорідненості, однак при цьому виникає специфічна спорідненість до промоторів - особливих ділянок, із яких має розпочинатися транскрипція. Субодиниця о, таким чином, виконує роль загального фактора ініціації транскрипції. Різні промотори розрізняються за спорідненістю до голоферменту (силою промотора). Відповідно, упізнання слабких промоторів залежить від додаткових, специфічних для даного гена чи групи генів, факторів ініціації.
Робочий цикл РНК-полімерази складається з таких стадій.
✵ Ініціація транскрипції, яка також є багатостадійним процесом (рис. 2.5):
1) зв'язування голоферменту з промотором;
2) локальне плавлення подвійної спіралі - розходження ланцюгів ДНК (на ділянці у 12-14 пар основ), яке дозволяє використовувати один із них як матрицю;
3) включення перших двох нуклеотидів у молекулу РНК (синтез першого фосфодіефірного зв'язку в активному центрі полімерази) є найповільнішою стадією процесу, яка може відбуватися тільки у присутності субодиниці σ;
4) зростання первинного короткого транскрипту - приєднання 8-9 нуклеотидів;
5) очищення промотора - дисоціація σ-фактора, яка маркує перехід до елонгації транскрипції.
Рис. 2.5. Ініціація транскрипції бактеріальною РНК-полімеразою
✵ Елонгація транскрипції, у кожному елементарному акті якої приєднується черговий нуклеотид до 3'-кінця РНК і кор-фермент пересувається на один нуклеотид уздовж матриці. При цьому разом із полімеразою переміщується також і розплавлена ділянка ДНК: одна пара основ руйнується попереду від полімерази, одна - відновлюється позаду. Синтез РНК відбувається із середньою швидкістю 40 нуклеотидів за секунду.
✵ Термінація транскрипції - визволення транскрипту, після чого кор-фермент знову взаємодіє з σ-субодиницею і здійснює новий пошук промотора. Сигнал термінації являє собою послідовність, транскрипція якої приводить до утворення у складі мРНК комплементарної дволанцюгової шпильки, безпосередньо фланкованої polyU послідовністю: цей елемент структури мРНК розпізнається полімеразою, унаслідок чого система руйнується. Іноді процес полегшується додатковими білковими факторами термінації.
РНК-полімераза характеризується асиметричною структурою: дві великі субодиниці - β і β' - формують характерні "щелепи", із внутрішньою поверхнею яких взаємодіє ДНК, розташована "нижче" (downstream) у напрямку руху полімерази. Глибоко між щелепами міститься каталітичний активний центр (рис. 2.6). Ці риси структурної організації є загальними для всіх інших РНК-полімераз: еукаріотичних і мономерних полімераз деяких бактеріофагів.
Рис. 2.6. Схема організації РНК-полімеразного комплексу (у розрізі) під час елонгації транскрипції
Асиметрична будова РНК-полімерази зумовлює два можливі способи, якими фермент може бути орієнтованим відносно ДНК: кожній із цих орієнтацій буде відповідати два протилежні напрямки руху при транскрипції. Відповідно, один із двох ланцюгів ДНК буде обиратися як матричний - той, з якого зчитується інформація у напрямку 3'-5' (рис. 2.6, 2.7). Послідовність ланцюга ДНК, який є комплементарним матричному, збігається з послідовністю РНК, що синтезується. Тому саме цей нематричний ланцюг називають кодуючим, або змістовним, - його послідовність прийнято наводити як послідовність даного гена (відповідно, матричний ланцюг називають антикодуючим). Нуклео- тид кодуючого ланцюга, який відповідає стартовому нуклеотиду РНК (частіше пуриновий), позначається як +1, наступні нуклеотиди (чи пари основ) у напрямку руху полімерази нумерують з позначкою "+": +2, +3 і т. д. У зворотному напрямку (ліворуч на рис. 2.7) нуклеотиди нумерують із позначкою "-" (починаючи з -1).
Рис. 2.7. Типовий промотор E. coli. Зелена стрілка позначає старт транскрипції всередині розплавленої зони
Типовий бактеріальний промотор (рис 2.7) складається з двох елементів послідовності, розташованих на відстані приблизно -10 і -35 від стартової точки. Консенсусна (узагальнена для різних промоторів) послідовність елемента -35 має вигляд T82T84G78A65C54A45 (числами позначено частоту зустрічальності даної основи у відсотках). Послідовність елемента -10 (називається також боксом Прибноу):
T80A95T45A60A50T96. Варіабельність послідовностей визначає різну ефективність ініціації - силу промоторів. Саме елементи -35 та -10 безпосередньо впізнаються σ-фактором при ініціації транскрипції. Наведені послідовності розпізнаються варіантом σ-фактора із молекулярною вагою 70 кДа (σ70), який є досить широко застосовуваним, однак він не єдиний. Кільком іншим варіантам о, під контролем яких перебувають певні групи промоторів, відповідають інші консенсусні послідовності -35 та -10. Взаємодія σ-фактора з промотором чітко орієнтує РНК-полімеразу щодо ДНК, тобто визначає як стартову точку транскрипції, так і її напрямок (вибір одного з двох ланцюгів як матричного).
Суттєвою особливістю прокаріотичної системи транскрипції білкових генів є те, що молекула мРНК зв'язується з рибосомами безпосередньо під час транскрипції - прокаріотична транскрипція і білковий синтез є єдиним процесом. При цьому мРНК, що синтезується на так званих оперонах - кластерах кількох генів, про які детальніше йтиметься нижче, містить кілька послідовних рамок зчитування та кілька стартових кодонів. Ініціація трансляції відбувається окремо на кожному з них усередині мРНК, і розпізнання цих стартових кодонів не залежить від їхнього розташування щодо 5'-кінця матриці (так звана внутрішня ініціація). Специфічне розміщення стартового кодо- на в Р-сайті рибосоми при ініціації трансляції у прокаріотів забезпечується комплементарним упізнанням між ділянкою рРНК 16S і консервативною послідовністю Шайна - Дальгарно, розміщеною в мРНК за 5-9 нуклеотидів від стартового кодона в напрямку до 5'-кінця. Саме наявність цієї послідовності й робить даний кодон AUG стартовим, відрізняючи його від звичайного метіонінового кодона.
Якщо рибосоми з тих чи інших причин не зв'язуються з мРНК, транскрипт швидко деградує під дією нуклеаз.