ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ - Е. Ю. Тюменцева - 2015

ТЕМА 6. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Жизнь микроорганизмов находится в тесной зависимости от условий окружающей среды. Как на растения, макроорганизмы, так и на микромир, существенное влияние оказывают различные факторы внешней среды. Их можно разделить на четыре группы: механические, химические, физические и биологические.

Механические факторы - передвижение, трение, растирание - действуют губительно на микроорганизмы. Горные быстро текущие реки почти не содержат микроорганизмов. Обычные реки также самоочищаются вследствие движения воды. Микробы разрушаются и при растирании их со стеклом, кварцевым песком, в агатовой ступке или шаровой мельнице.

Физические факторы. К ним относятся температура, высушивание, лучи света, радиоактивные излучения, ультразвук, высокое давление.

Температура. Жизнедеятельность каждого микроорганизма ограничена определенными температурными границами. Эту температурную зависимость обычно выражают тремя точками: минимальная (min) температура - ниже которой размножение прекращается, оптимальная (opt) температура - наилучшая температура для роста и развития микроорганизмов и максимальная (max) температура - температура, при которой рост клеток или замедляется, или прекращается совсем.

Все микроорганизмы по отношению к температуре условно можно разделить на 3 группы. Первая, психрофилы - это холодолюбивые микроорганизмы. К таким микроорганизмам относятся обитатели северных морей и водоемов. К действию низких температур многие микроорганизмы очень устойчивы. Например, холерный вибрион долго может храниться во льду, не утратив при этом своей жизнеспособности. Некоторые микроорганизмы выдерживают температуру до -190 °С, а споры бактерий могут выдерживать до -250 °С. Действие низких температур приостанавливает гнилостные и бродильные процессы, поэтому в быту мы пользуемся холодильниками. При низких температурах микроорганизмы впадают в состояние анабиоза, при котором замедляются все процессы жизнедеятельности, протекающие в клетке.

Ко второй группе относятся мезофилы - это наиболее обширная группа бактерий, в которую входят сапрофиты и почти все патогенные микроорганизмы, так как optтемпература для них 37 °С (температура тела), min t = 10 °С, max t = 45 °C.

К третьей группе относятся термофилы - теплолюбивые бактерии, развиваются при t выше 55 °С, min t для них = 30 °С, max t = 7076 °С. Эти микроорганизмы обитают в горячих источниках. Среди термофилов встречается много споровых форм. Споры бактерий гораздо устойчивей к высоким температурам, чем вегетативные формы бактерий. Например, споры бацилл сибирской язвы выдерживают кипячение в течение 10-20 с. Все микроорганизмы, включая и споровые, погибают при температуре 165-170 °С в течение часа. Действие высоких температур на микроорганизмы положено в основу стерилизации.

Высушивание. Для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов нужна вода. Высушивание приводит к обезвоживанию цитоплазмы, нарушается целостность цитоплазматической мембраны, что ведет к гибели клетки. Некоторые микроорганизмы под влиянием высушивания погибают уже через несколько минут: это менингококки, гонококки. Более устойчивыми к высушиванию являются возбудители туберкулеза, которые могут сохранять свою жизнеспособность до 9 месяцев, а также капсульные формы бактерий. Особенно устойчивыми к высушиванию являются споры. Например, споры плесневых грибов могут сохранять способность к прорастанию в течение 20 лет, а споры сибирской язвы могут сохраняться в почве до 100 лет.

В природе бактериальные клетки постоянно подвергаются воздействию солнечной радиации. Прямые солнечные лучи губительно действуют на микроорганизмы. Это относится к ультрафиолетовому спектру солнечного света (УФ-лучи), они инактивируют ферменты клетки и разрушают ДНК. Патогенные бактерии более чувствительны к действию УФ-лучей, чем сапрофиты. Поэтому в бактериологической лаборатории микроорганизмы выращивают и хранят в темноте.

На микроорганизмы оказывают влияние и другие виды лучистой энергии - это рентгеновское излучение, α-, β- и γ-лучи оказывают губительное действие на микроорганизмы только в больших дозах. Эти лучи разрушают ядерную структуру клетки. В последние годы радиационным методом стерилизуют изделия для одноразового использования - шприцы, шовный материал, чашки Петри.

Малые дозы излучений, наоборот, могут стимулировать рост микроорганизмов.

Ультразвук вызывает поражение клетки. Под действием ультразвука внутри клетки возникает очень высокое давление. Это приводит к разрыву клеточной стенки и гибели клетки. Ультразвук используют для стерилизации продуктов: молока, фруктовых соков.

Высокое давление. К атмосферному давлению бактерии, а особенно споры, очень устойчивы. В природе встречаются бактерии, которые живут в морях и океанах на глубине 1000-10000 м под давлением от 100 до 900 атм. Сочетанное действие повышенных температур и повышенного давления используется в паровых стерилизаторах для стерилизации паром под давлением.

Химические факторы оказывают исключительно сильное влияние на микроорганизмы. Одни и те же химические вещества (сахар, поваренная соль, ртуть и др.) в малых дозах стимулируют развитие микроорганизмов, в повышенных тормозят, а в высоких убивают микробов. Некоторые химические вещества обладают особо губительными свойствами. Их называют антисептическими или дезинфицирующими веществами.

Биологические факторы. Микроорганизмы, находясь в естественных условиях существования, вступают в определенные взаимоотношения с другими видами микроорганизмов. Эти взаимоотношения могут проявляться в виде симбиоза, метабиоза и антагонизма.

Симбиоз - это такое сожительство, когда один вид не мешает развитию другого, метабиоз - сожительство, при котором один вид создает благоприятные условия для другого, и антагонизм - сожительство, при котором один вид микроорганизма подавляет развитие другого.

Не все микроорганизмы погибают под влиянием внешних воздействий. Некоторые из них, приспособляясь, приобретают новые свойства, изменяются.

Различают следующие виды изменчивости микроорганизмов:

1) диссоциация - измельчение гладких форм колоний (S-форма) в шероховатые (R-форма). Такой переход от S- к R-форме совершается под влиянием бактериофага и других внешних условий. С изменением формы микроорганизма меняются его некоторые морфологические и физиологические свойства;

2) адаптация - приспособление к новым условиям существования, это временные изменения;

3) трансформация - передача определенных свойств одного микроорганизма другому посредством дезоксирибонуклеиновой (ДНК) или рибонуклеиновой кислот (РНК);

4) мутация - вновь возникающее изменение свойств микроорганизма, передающееся по наследству.

Методика выполнения лабораторной работы

Цель работы: изучить теоретический материал, научиться проводить подготовку и стерилизацию посуды и инструментов для микробиологического исследования; изучить технику фаготипирования.

Материалы, реактивы, оборудование: чашки Петри; скальпели; почва; пищевые продукты; пробирки; пипетки; шпатели; среда Отто или Грациа; 1,5%-ный МПА; 5%-ный раствор глицерина; пророщенная бульонная культура; термостат.

Изучить материал приложения 3 и провести опыты.

Опыт № 1. Подготовка и стерилизация лабораторной посуды

а) подготовка к стерилизации лабораторной посуды:

1) перед стерилизацией лабораторную посуду тщательно моют и сушат;

2) пробирки, флаконы, бутыли, колбы закрывают ватномарлевыми пробками. Поверх пробки на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок;

3) чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1-5 штук или в пеналах;

4) пастеровские пипетки по 3-5-10-15 штук заворачивают в плотную оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец;

б) стерилизация лабораторной посуды:

1) сухим жаром при температуре 150, 160 и 180 °С соответственно 2 часа, 1 час и 30 минут;

2) в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 20-30 минут;

в) стерилизация металлических инструментов:

Ножницы, скальпели, пинцеты и пр. стерилизуют в 2%-ном содовом растворе (сода предупреждает появление ржавчины и потерю остроты). Лезвия скальпелей и ножниц перед погружением в воду рекомендуется обертывать ватой;

г) стерилизация перчаток и других резиновых изделий:

Перчатки, шланги, трубки и другие изделия, загрязненные вегетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2%-ном растворе соды или текучим паром 30 мин; при загрязнении спороносной патогенной микрофлорой - в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30мин.

Задание: Провести подготовку и стерилизацию посуды и металлических инструментов, выданных преподавателем.

Опыт № 2. Выделение бактериофага из патологического материала

Исследуемую жидкость фильтруют от микробов.

Твердый исследуемый материал (почва, пищевые продукты) измельчают в ступке, эмульгируют, фильтруют. Наличие фага в полученном фильтрате определяют в жидких питательных средах или на плотных средах по методу Отто или Грациа.

Обнаружение бактериофага на плотных питательных средах по методу Отто: 1,5 % МПА разливают в чашки Петри (более высокая концентрация агара угнетает развитие колоний бактериофага). После застудневания МПА засевают 16-18-часовой бульонной культурой бактерий, гомологичных искомому фагу. Для получения сплошного роста посев растирают шпателем. Спустя 5-10 мин после посева на подсушенную поверхность каплями наносят исследуемый фильтрат. Чашки ставят в термостат на 18-24 часа при температуре 37 °С.

Интерпретация результатов: доказательством наличия бактериофага служит полное отсутствие роста культуры в месте попадания капли фильтрата (активный бактериофаг) или появление в этом месте мелких стерильных пятен-колоний бактериофага (бактериофаг слабой активности).

Опыт № 3. Техника фаготипирования микробов по методу Креджи и Иенсена

В основу фаготипирования положен принцип совместного выращивания типируемой культуры с типовым бактериофагом. Наступление лизиса определяет типовую принадлежность бактерий. Для фаготипирования бактерий применяют 1,5 % МПА с 5%-ным раствором глицерина. Пророщенную бульонную культуру каплями наносят на поверхность питательной среды. Капли не должны растекаться. Они должны впитаться в течение 3-10 мин.

Затем на поверхность каждой капли наносят по 1 капле типового фага с таким расчетом, чтобы часть культуры оставалась свободной от воздействия бактериофага (для контроля роста культуры). Чашки помещают в термостат при температуре 37 °С: через 6-8 часов производят учет результатов фаготипирования.

Наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с одним из типовых фагов указывает на принадлежность культуры к данному фаготипу.

Оформление и анализ результатов исследований

1. Изучить и записать теоретический материал.

2. Провести стерилизацию лабораторной посуды и инструментов.

3. Провести выделение бактериофага из патологического материала и интерпретировать результаты.

4. Изучить технику фаготипирования и провести фаготипирование по методу Креджи и Иенсена.

После ознакомления с данной темой студенты научатся проводить стерилизацию лабораторной посуды и инструментов, проводить выделение бактериофага из патологического материала, изучат технику фаготипирования.

Контрольные вопросы

1. В чем состоит взаимозависимость организма и внешней среды?

2. Что понимается под термином «анабиоз»?

3. В чем сущность действия на микроорганизмы пастеризации и стерилизации, света, радиоактивных излучений, радиоволн, ультразвука, рН среды?

4. Что такое симбиоз и метабиоз?

5. Что такое антагонизм?

6. Дайте определение психрофилам, мезофилам и термофилам. Каких представителей микроорганизмов больше на планете?

7. Какие виды изменчивости микроорганизмов Вы знаете? Опишите их.

8. Как подготовить к стерилизации лабораторную посуду?

9. Каким образом проводят стерилизацию лабораторной посуды, металлических инструментов, резиновых изделий?

10. Опишите технику фаготипирования микробов по методу Креджи и Иенсена.