Основы биоинформатики - Огурцов А.Н. 2013

Информационные принципы в биотехнологии
Биоинформатика в фармации
Открытие и разработка лекарств

Лекарственный препарат - это химическое вещество, молекула которого взаимодействует со специфической биологической молекулярной "мишенью" (drug target) внутри организма и посредством такого взаимодействия вызывает тот или иной физиологический эффект.

Молекулярные мишени обычно относятся к белкам. В зависимости от производимого ими эффекта, лекарства могут оказывать благотворное или вредное влияние на организм.

Цель фармацевтической промышленности состоит в разработке медикаментов, обладающих определёнными целебными эффектами и предназначенных для излечения многих заболеваний, особенно болезней человека.

Лекарственным препаратом можно назвать только такое химическое соединение, которое отвечает следующим требованиям. Оно должно быть:

✵ безопасным;

✵ эффективным;

✵ устойчивым (и химически и метаболически);

✵ легко усвояемым (должно быстро всасываться и переноситься к участку воздействия);

✵ фармацевтически доступным (путём выделения из естественных источников или химического синтеза);

✵ новым (оригинальным), то есть патентоспособным.

Разработку новых медикаментов можно проводить двумя методами: эмпирическим и рациональным.

Эмпирический метод - это слепой метод проб и ошибок; его называют также методом чёрного ящика. Тысячи химических соединений испытывают на патогенах или опытных организмах, даже не зная мишень, на которую препарат воздействует, и механизм его действия. Впрочем, иногда может произойти случайное открытие, подобное открытию пенициллина.

Обычно на медикаментозную активность проверяют тысячи химических соединений — лидов (lead compound). Как правило, лишь одно из 10000 может действительно поразить мишень. В подобного рода подходах никто не знает заранее, какую мишень препарат атакует и каков сам принцип воздействия.

Рациональный подход начинается с детального изучения мишени и механизма, приводящего к её поражению. Открытие лекарственных препаратов включает в себя задачи обнаружения мишени и поиска того "снаряда"-лида, который может её поразить. Мишень относится к причинному фактору болезни, а лид - к активной молекуле, которая взаимодействует с этим причинным фактором. При медикаментозном лечении болезни лекарства взаимодействуют с мишенями, которые так или иначе способствуют развитию болезни, влияют на их активность и таким образом производят различные положительные эффекты.

Терапевтическая мишень может быть эндогенной (белок, синтезируемый в организме пациента, которому назначен препарат) или, в случае инфекционных заболеваний, - экзогенной (белок, производимый болезнетворным организмом). Медикаменты либо стимулируют, либо подавляют активность белка-мишени.

Фармакологические мишени. На самом деле разработка препарата оказывается не столь лёгкой задачей. Это невероятно сложный, продолжительный и дорогостоящий процесс. Получение препарата начинается с установления потенциально подходящей мишени болезни. Этот процесс называют опознаванием мишени.

Еще в начале XX в. Дж. Лэнгли сформулировал общее теоретическое понятие "рецептивной субстанции", благодаря взаимодействию с которой вещество (например, кураре (curare)) вызывает биологический эффект (в случае кураре - мышечный паралич). Эта концепция с тех пор используется для объяснения количественной зависимости фармакологического действия от концентрации вещества.

Начиная с 80-х годов XX века, после первых экспериментов по клонированию и выяснению первичной структуры никотинового холинорецептора, стали быстро развиваться представления о специфических молекулярных мишенях (или фармакологических мишенях - drug targets).

Большинство фармакологических мишеней - это белки. Уже идентифицировано около 1000 белков-мишеней, и ожидается, что общее их число составит не менее 10000. Наибольшая доля известных фармакологических мишеней (около 50% от общего их числа) приходится на рецепторы клеточных мембран. Затем следуют ферменты (около 30%). Важную группу составляют ионные каналы и белки-переносчики нейромедиаторов и гормонов (дофамина, серотонина, норадреналина, ГАМК (GABA) и других).

Самой многочисленной группой белков-мишеней являются рецепторы, сопряжённые с G-белками (GPCR, G-protein coupled receptors). Это обширное и функционально разнообразное семейство белков, которые передают сигнал через клеточную мембрану и тем самым регулируют многие биохимические процессы в клетках. Через посредство активации GPCR осуществляется биологическое действие примерно 80% известных к настоящему времени гормонов и нейромедиаторов (например, дофамина, серотонина).

Химическое соединение (лиганд), которое при взаимодействии с рецептором изменяет его состояние, приводя к биологическому отклику, называется агонистом.

Обычные агонисты увеличивают отклик рецептора, обратные агонисты уменьшают его, а антагонисты блокируют действие агонистов.

Агонисты и антагонисты являются примерами модуляторов фармакологических мишеней. Модуляторы мишеней делятся на положительные и отрицательные (таблица 24).

Таблица 24 - Классификация модуляторов фармакологических мишеней

В зависимости от того, в каком сигнальном пути участвует конкретный рецептор, агонисты GPCR вызывают разный ответ. Это означает, что активному состоянию рецептора могут соответствовать разные конформации белка. Некоторые GPCR спонтанно осциллируют между активной и неактивной конформацией, то есть обладают конститутивной активностью (такой, которая возникает в отсутствие действия агониста). Иногда конститутивная активность бывает обусловлена специфическими мутациями, в результате которых нарушаются внутримолекулярные взаимодействия, удерживающие рецептор в неактивной конформации.

Антагонисты, действующие как обратные агонисты, переводят активированный рецептор в неактивную конформацию, снижая его базальную конститутивную активность. Многие терапевтические средства, считавшиеся антагонистами GPCR, оказались обратными агонистами, а другие лекарства могут взаимодействовать с GPCR как антагонисты и как обратные агонисты.

Для выяснения механизмов связывания антагонистов и обратных агонистов с GPCR-рецепторами применяется компьютерное моделирование структур GPCR-белков на основе уже известных структур белков.

Одно из важных направлений поиска новых белков-мишеней действия антибактериальных средств стимулируется быстрым появлением микроорганизмов, резистентных к уже имеющимся препаратам. Сравнительный анализ геномов патогенных микроорганизмов, человека и микроорганизмов-симбионтов позволяет идентифицировать белки, необходимые для жизнедеятельности патогена, но отсутствующие у человека и его симбионтов.

Чтобы понять, как функционирует белок-мишень, необходимо знать не только его первичную аминокислотную последовательность, но и трёхмерную структуру макромолекулы, а также установить место связывания лиганда. При этом хорошие результаты даёт сочетание экспериментальных методов молекулярной биологии (рентгеноструктурного анализа, ЯMР-спектроскопии) с компьютерными методами. Однако до сих пор разрыв между числом известных аминокислотных последовательностей и числом установленных пространственных структур белков не сокращается, а возрастает.

Если пространственная структура белка-мишени неизвестна, пытаются построить его трёхмерную модель. Современное молекулярное компьютерное моделирование состоит из четырёх основных элементов:

✵ компьютерная графика;

✵ расчёты квантовой механики;

✵ расчёты молекулярной механики;

✵ моделирование молекулярной динамики.

С помощью компьютерной графики визуализируется пространственное расположение атомов и распределение электростатических потенциалов в молекулах. Это стало новым эффективным методом анализа соотношений структура-активность биологически активных соединений.

Методы квантовой механики позволяют довольно точно рассчитывать структуру и электростатические потенциалы для небольших молекул, но квантово-механические расчёты белковых структур требуют много компьютерного времени. Расчёты методами молекулярной механики менее точны, но производятся быстро, и определение структуры белка из нескольких сотен аминокислотных остатков можно выполнить на персональном компьютере.

Независимо от того, с помощью каких вычислительных процедур производилось уточнение структуры белка, первоначальные параметры модели существенно влияют на конечную модель, оптимизированную с помощью процедур минимизации энергии. После расчёта конформации белка с минимальной внутренней энергией возможно исследовать взаимодействие различных лигандов с известным участком связывания.

При создании моделей белков-мишеней нужно иметь в виду, что в естественных условиях они не статичны, их геометрия непрерывно меняется, причем масштабы времени исчисляются фемтосекундами (10^-15 с). Для исследования внутримолекулярных движений и уточнения трёхмерных структур белков применяется моделирование молекулярной динамики, при котором молекуле сообщается начальный импульс. Молекулярно-динамические расчёты производятся после минимизации энергии и состоят из большого числа вычислительных этапов, так что для получения модели макромолекулы, соответствующей масштабам даже нескольких наносекунд (10-⁹ с), нужны очень мощные компьютеры.

За опознаванием мишени следует процесс её утверждения. Последний предполагает всесторонние испытания терапевтического потенциала молекулярной мишени. Этот процесс может включать в себя моделирование болезней на опытных животных и анализ данных об экспрессии генов и белков. Путём сравнения уровней экспрессии генов в нормальном и болезненном состоянии новые медикаментозные мишени могут быть обнаружены in silico с использованием микроматриц.

После того, как установлен ген, который в болезненном состоянии обнаруживает повышающую или понижающую регуляцию (экспрессируемый на более высоком или низком уровне, чем в нормальной ткани), определяют его природу с помощью методов биоинформатики. Кроме того, используя программу BLAST, проводят поиск подобных ему генов или белков в базах данных последовательностей.

Подобные гены и белки помогают определять функцию подверженного регуляции гена. Если оказывается, что мишень принадлежит к одному из классов структур, которые относительно легко поддаются медикаментозному воздействию (рецепторы, ферменты или ионные каналы), то это значительно упрощает и удешевляет дальнейший процесс разработки лекарств.

Адекватная мишень должна обладать высоким терапевтическим показателем, то есть должна быть гарантия существенного терапевтического эффекта при введении такого препарата. Если мишенью является известный белок, то активность к связыванию может быть измерена непосредственно. Потенциальный противомикробный препарат может быть испытан путём наблюдения его воздействия на рост культуры патогенных микроорганизмов. Эффект некоторых соединений можно проверять на эукариотических клетках, выращенных в культуре тканей. Если какое-либо лабораторное животное восприимчиво к данной болезни, то испытания медикамента могут быть проведены на группе опытных животных.

Если найденная мишень является ферментом, то изучают следующие признаки:

✵ активный участок и участвующие в его формировании аминокислоты;

✵ наличие или отсутствие в его составе ионов металлов;

✵ число водородных доноров и акцепторов, находящихся в активном участке;

✵ топология активного участка;

✵ данные о гидрофобных и гидрофильных аминокислотах, присутствующих в активном участке.

Если мишень оказывается биохимическим веществом или субстратом какого-либо фермента, то проводят оценку следующих факторов:

✵ размер молекулы;

✵ химическая природа молекулы;

✵ наличие групп, показывающих донорную или акцепторную ёмкость (по отношению к водороду);

✵ побочные продукты метаболизма;

✵ возможности химической модификации этого соединения.

После окончательного утверждения мишени начинается поиск лидов, которые взаимодействуют с этой мишенью, а после обнаружения лида, он должен быть оптимизирован (см. п. 15.2). После оптимизации лиды оценивают по качеству, принимая во внимание такие факторы, как лёгкость синтеза и приготовления лекарственной формы. Затем оптимальное соединение регистрируют как новый разработанный препарат и направляют на клинические испытания.

Клинические испытания - это самая длительная и дорогостоящая стадия процесса разработки препарата. Именно по этой причине большая часть проектов останавливается перед этим этапом. Клинические испытания призваны определить уровень безопасности и переносимости препарата при лечении пациентов и определить его метаболический путь в организме.

Испытания лекарственных препаратов проводят в несколько стадий.

✵ Доклиническая стадия - испытания на опытных животных.

✵ Стадия 1 - испытания на нормальных (здоровых) добровольцах.

✵ Стадия 2 - оценка безопасности и эффективности воздействия на пациентов, выбор дозы и режима приема.

✵ Стадия 3 - сравнение эффекта в группах пациентов, принимающих новый препарат и плацебо, или компаратор; финалом этой стадии является сертификация и разрешение о выпуске лекарства в продажу.

✵ Стадия 4 (постклиническая) - длительное отслеживание побочных реакций в ходе применения лекарства, о которых сообщают фармацевты и доктора.

В развитие методики разработки лекарственных препаратов неоценимый вклад внесли геномика, протеомика, комбинаторная химия и технология высокопроизводительных отборочных испытаний.

Геномика и протеомика коренным образом изменили подход к опознаванию и утверждению молекулярных мишеней. Традиционно мишени для медикаментозного воздействия оценивались путём наблюдений над пациентами и подбора опытных соединений, дающих желательный клинический эффект.

С появлением геномики и, в частности, секвенирования полного генома человека и его аннотаций тысячи новых потенциальных мишеней могут быть опознаны по последовательности, структуре и функции.

Биоинформатика необходима не только при анализе последовательностей и структур, но также и для построения алгоритмов моделирования взаимодействий белка-мишени с молекулами препарата. Благодаря этому стала возможной именно рациональная разработка препаратов, где на основании данных о структуре белка предсказывают тип лигандов, взаимодействующих с данной мишенью, и таким образом существенно сужают диапазон соединений, среди которых проводится поиск лидов.

В последнее время для распознавания опытных соединений начали применять систематические методы. Эти методы основаны на высокопроизводительных отборочных испытаниях, в которых открытие лидов ускорено за счёт высокопараллельных форм для анализа (например, мультилуночных планшетов). В свою очередь внедрение таких технологий требует создания больших химических библиотек для проведения испытаний. Это стало возможным благодаря методам комбинаторной химии, посредством которых большое число различных соединений может быть синтезировано путём объединения и разделения реагентов между очередными стадиями реакции.