ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ - Е.П. СУЧКОВА - 2016
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2
ПРИГОТОВЛЕНИЕ И МИКРОСКОПИРОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ МИКРОРГАНИЗМОВ
Цель занятия - освоить методы приготовления и особенности исследования препаратов живых и фиксированных клеток.
Ход работы. Выполняются задания:
Задание 1. Ознакомиться с морфологическим составом и характеристиками микроорганизмов.
Задание 2. Приготовление и микроскопирование препаратов «раздавленная» и «висячая» капля.
Для выполнения работы в соответствии с методическими указаниями приготовить на предметных стеклах препараты «раздавленная капля» и «висячая капля» из культур молочнокислых бактерий или заквасок. Просмотреть с объективом 40 под микроскопом. Зарисовать.
Задание 3. Приготовление окрашенных препаратов. На предметных стеклах приготовить мазки из культур молочнокислых бактерий или заквасок, по 2 мазка из каждой культуры. Освоить технику приготовления окрашенных препаратов. Окрасить первые мазки простым методом с применением метиленовой сини, а вторые - по методу Грама.
Задание 4. Микроскопирование препаратов, окрашенных по методу Грама. Просмотреть окрашенные препараты с иммерсионным объективом 90. Зарисовать цветными карандашами.
Методические указания
Оборудование и материалы: биологические объекты, микроскоп, предметные стекла, иммерсионное масло, бактериологические петли, фильтровальная бумага, предметное стекло с лункой, покровные стекла, спиртовки, растворы основных красок: фуксин Пфейффера, краска Грама, раствор Люголя, раствор метиленовой сини, вода дистиллированная, спирт 96 %.
Для изучения микроорганизмов пользуются сложными оптическими приборами - микроскопами. Микроскопы, применяемые в лабораториях, бывают оптические (монокулярные, бинокулярные), люминесцентные, а также электронные.
Оптический микроскоп состоит, в свою очередь, из механической и оптической частей (рис. 2). Механическая часть состоит из штатива, тубуса, предметного столика и винтов. Штатив включает основание, которое служит опорой микроскопа, и тубусодержатель, используемый для крепления подвижного тубуса и в качестве ручки для переноса микроскопа.
Рис. 2. Устройство светового микроскопа: 1 - основание микроскопа; 2 - тубусодержатель; 3 - тубус; 4 - окуляр (чаще х7); 5 - револьвер микроскопа; 6 - объективы (сухой: х8, х20, х40; иммерсионный х90); 7 - предметный столик; 8 - конденсор; 9 - макрометрический винт; 10 - микрометрический винт; 11 - винт конденсора; 12 — зеркало
Тубус - это зрительная труба микроскопа. В верхнее отверстие тубуса свободно вставляется окуляр, а на нижнем его конце находится вращающийся вокруг своей оси барабан револьвера, в который ввинчиваются объективы. Вращая барабан револьвера, можно быстро центрировать объективы в процессе работы с микроскопом, т. е. ставить объективы в оптическую ось тубуса микроскопа. На револьвере напротив объектива имеется желобок, в который входит ступица (пружинка), закрепляющая объектив в центрированном положении. При попадании ступицы в желобок ощущается щелчок и требуется некоторое усилие для выведения револьвера из этого положения.
Предметный столик предназначен для размещения изучаемого препарата. Препарат закрепляют имеющимися на столике пружинными клеммами. В центре предметного столика есть отверстие для прохождения лучей света, освещающих препарат. Предметный столик можно передвигать в двух взаимно перпендикулярных направлениях с помощью двух винтов, симметрично расположенных на краях, или в разных направлениях посредством боковых винтов. Вместе со столиком передвигается и препарат, что позволяет рассматривать его в разных местах.
Винты (микрометрический и макрометрический) позволяют передвигать тубус вверх и вниз для установления находящихся на нем объективов на необходимом расстоянии от препарата (так, чтобы препарат находился в фокусе данного объектива). При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается, а против часовой стрелки - поднимается. Макрометрическим винтом пользуются для предварительной установки объектива, т. е. установки его на такое удаление от препарата, при котором препарат становится видимым. При работе с объективами 40 и 90 для точной их установки используют также микрометрический винт, полный оборот которого передвигает тубус всего на 0,1 мм. Этот винт имеет сложное устройство и может испортиться при неправильном обращении с ним, его можно поворачивать не более чем на 180° в ту или другую сторону.
Оптическая часть микроскопа состоит из осветительной и оптической систем. Осветительная система микроскопа находится под предметным столиком и состоит из зеркала и конденсора с диафрагмой. Зеркало отражает лучи света от источника и направляет их в сторону конденсора. Зеркало двухстороннее: одна сторона плоская, другая вогнутая. При дневном освещении пользуются плоским, а при искусственном (электрическом) освещении - вогнутым зеркалом.
Зеркало имеет две взаимно перпендикулярные оси, позволяющие установить его в разнообразных положениях для наилучшего отражения света от источника. Конденсор служит для лучшего освещения препарата и состоит из нескольких линз, благодаря которым он собирает отраженные от зеркала световые лучи в сильный световой пучок и направляет их через отверстие предметного столика на препарат, а затем в объектив. Конденсор с помощью винта (кремальеры конденсора) можно продвигать вверх и вниз. Чем ниже опускается конденсор, тем слабее освещается препарат, и наоборот. При микроскопировании неокрашенных препаратов (с объективами 8 и 40) конденсор опускают так, чтобы лучше были видны микробы, а при микроскопировании окрашенных препаратов и работе с объективами большего увеличения его поднимают вверх до предела. Диафрагма находится под конденсором и служит для регулирования количество света, поступающего в конденсор. Так называемая ирисовая диафрагма состоит из ряда подвижных металлических пластинок, которые сдвигаются и раздвигаются, в результате чего отверстие диафрагмы может изменяться.
Оптическая система микроскопа состоит из объективов и окуляров. Объектив представляет собой систему линз, заключенных в металлическую оправу. Линза, обращенная к объекту, называется фронтальной. Объектив обладает определенной увеличительной (разрешающей) способностью. Чем больше кривизна линз, тем короче фокусное расстояние и больше разрешающая способность объектива.
Объектив дает действительное, увеличенное, обратное изображение объекта и выявляет его детали. Биологические микроскопы М-10, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3 имеют три объектива, дающих разное увеличение. На оправу каждого объектива нанесена цифра, показывающая увеличение, даваемое данным объективом: на одном 8, на другом 40, на третьем 90 (на объективах других моделей микроскопов могут быть нанесены другие цифровые или буквенные обозначения). Фокусное расстояние объектива 8 равно 9 мм, 40 - 0,65 мм и объектива 90 - 0,15 мм.
Объективы подразделяются на сухие и иммерсионные (масляно-погружные). При рассмотрении препарата с помощью сухих объективов (8 и 40) между их фронтальной линзой и препаратом находится воздух. При работе с иммерсионным объективом (90) для предотвращения рассеивания света пространство между фронтальной линзой объектива и препаратом заполняют кедровым (иммерсионным) маслом (нижнюю часть объектива погружают в каплю масла), которое имеет показатель преломления, приблизительно равный показателю преломления стекла.
Окуляр состоит из двух линз, заключенных в металлическую оправу. Нижняя линза называется собирательной, верхняя - глазной. Окуляр увеличивает изображение, данное объективом, т. е. дает мнимое изображение, поэтому чем в большей степени увеличивает окуляр, тем менее четким будет изображение. Биологические микроскопы имеют 3 окуляра с увеличением в 7, 10 и 15 раз. Таким образом, общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, при работе с объективом 8 и окуляром 10 общее увеличение будет равно 80, с объективом 40 и окуляром 10 - 400 и при работе с объективом 90 и окуляром 10 - 900. Пользуясь оптическим микроскопом, можно рассмотреть предмет величиной не менее 0,2 мкм (1 мкм - 1 микрометр, равный 0,001 мм), так как разрешающая способность объектива не может быть больше половины длины волны воспринимаемого глазом света. Реальная разрешающая способность объектива равна частному от деления средней длины волны воспринимаемого глазом света на числовую апертуру данного объектива, которая указана на нем и характеризует количество проходящего через объектив света. Например, разрешающая способность объектива 8 0,55 мкм: 0,20 - 2,75 мкм; объектива 40 0,55 мкм: 0,65 - 0,85 мкм, объектива 90 0,55 мкм: 1,25 - 0,44 мкм.
Методика приготовления неокрашенных препаратов
Препараты микроорганизмов готовят на чистых и обезжиренных предметных стеклах длиной 76 мм, шириной 26 мм и толщиной 1-2 мм. Часто используют и покровные стекла 18x18 или 20x20 мм и толщиной 0,15-0,17 мм.
Если нужно исследовать микроорганизмы в живом виде, готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля». Для приготовления первого препарата на середину предметного стекла наносят каплю жидкой культуры (бактерий, дрожжей) или стерильной водопроводной воды, в которую бактериологической петлей вносят немного исследуемых микробов из их колоний на плотной среде. Каплю осторожно накрывают (раздавливают) покровным стеклом. Капля должна тонким слоем заполонить пространство между предметным и покровным стеклами, но не должна выступать за края покровного стекла. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой.
Для приготовления препарата «висячая капля» взвесь микробов петлей наносят на центральное место покровного стекла и к нему прикладывают предметное стекло с «луночкой» (углублением) так, чтобы капля оказалась под центром «луночки». Перед этим вокруг «луночки» наносят тонким слоем вазелин. После перевертывания предметного стекла луночкой вверх капля будет «висеть» над ней. Для изучения грибов с помощью двух препаровальных игл берут небольшой кусочек мицелия, который вносят в каплю воды или ее смеси с глицерином, осторожно расщепляя иглами. Неокрашенные препараты бактерий и дрожжей микроскопируют, используя объектив 40, а плесневых грибов - объективы 8 и 40.
Для приготовления препарата дрожжей или бактерий с прижизненной (витальной) окраской клеток на предметное стекло наносят крупную каплю красителя метилового голубого по Лефферу или каплю фуксина Пфейффера и в эту каплю вносят суспензию микроорганизмов. Затем петлей или пипеткой краску перемешивают с суспензией микроорганизмов, кладут на эту каплю покровное стекло и слегка его придавливают. Получают «раздавленную каплю» живых окрашенных микробов, которую микроскопируют так же, как и обычную «раздавленную каплю».
В окрашенном виде клетки микробов видны более ясно и четко, чем в неокрашенном, при этом мертвые клетки окрашиваются быстро, а живые - плохо. Применяя специальные красители - флуорохромы (например, примулин) и люминесцентную микроскопию, можно дифференцировать (различать) живые и мертвые клетки дрожжей.
Техника микроскопирования неокрашенных препаратов
Микроскоп вынимают из футляра и переносят, не наклоняя, на рабочее место, держа его одной рукой за тубусодержатель, а другой - за ножку штатива. Помещают микроскоп на рабочем столе тубусодержателем к себе от края стола на расстоянии 3-5 см.
Устанавливают хорошее равномерное освещение поля зрения микроскопа, для чего, глядя в окуляр, зеркалом направляют луч света от источника в объектив, настройку освещения производят, используя объектив 8. Конденсор должен быть поднят вверх, а диафрагма открыта. Поле прения микроскопа должно быть хорошо и равномерно освещено во всех точках.
На предметный столик помещают исследуемый препарат мазком или каплей вверх и закрепляют клеммами. Рассматривают препарат, используя объектив 8, а затем переходят к большим увеличениям. При работе с объективом 8 расстояние между препаратом и объективом (фокусное расстояние) составляет около 9 мм, с объективом 40 - 0,65 мм и с объективом 90 - около 0,15 мм. Тубус микроскопа вместе с центрированным объективом осторожно опускают вниз с помощью макрометрического винта, наблюдая сбоку, с таким расчетом, чтобы фокус объектива был ниже рассматриваемого препарата. При работе с объективами 40 и 90 необходимо приблизить объектив почти вплотную к препарату, не касаясь его. Затем, глядя в окуляр, с помощью того же винта, медленно вращая его на себя, поднимают тубус до тех пор, пока в поле зрения не появится изображение объекта. После этого вращением микрометрического винта точно фокусируют объектив, чтобы изображение предмета было четким. Микрометрический винт можно поворачивать не более чем на пол-оборота.
Для получения наилучшего изображения препарата необходимо регулировать интенсивность его освещения, опуская или поднимая конденсор, открывая или прикрывая диафрагму. Обычно при рассматривании препарата в объектив 8 конденсор несколько опускают, при работе с объективом 90 - поднимают вверх.
Препарат рассматривают в нескольких местах, передвигая предметный столик с помощью боковых винтов. В процессе микроскопирования препарата медленно (на 1/4 оборота) вращают микрометрический винт по часовой стрелке и против нее так, чтобы можно было рассмотреть препарат во всей его толще. Если какое-либо место препарата, рассматриваемое при малом увеличении, требуется просмотреть при большем увеличении, то необходимо это место поставить в центре поля зрения, а затем центрировать соответствующий объектив.
Неокрашенные препараты («раздавленная» и «висячая» капли) микроскопируют с объективами 8 и 40. Для этого устанавливают освещение поля зрения как указано выше, а затем опускают конденсор на 1-0,5 см, добиваясь наилучшей видимости неокрашенных клеток.
При микроскопировании «висячей капли» сначала находят ее край, проводя микроскопирование с объективом 8; препарат устанавливают таким образом, чтобы центр капли был в центре поля зрения объектива. После этого производят микроскопирование с объективом 40.
Приготовление окрашенных препаратов
Приготовление мазка заключается в следующем. На середину чистого обезжиренного стекла наносят стерильной петлей жидкую бактериальную культуру или каплю стерильной водопроводной воды и вносят в нее бактерии, взятые из колоний кончиком стерильной бактериологической петли. Полученную слабо-мутную бактериальную суспензию равномерно распределяют тонким слоем на поверхности предметного стекла на площади 2 см2.
Высушивание мазка осуществляют при комнатной температуре или (для ускорения) в потоке теплого воздуха над небольшим пламенем горелки (мазком вверх), не допуская нагрева стекла.
Фиксацию мазка осуществляют термическим и химическим способами. При термическом способе стекло с высушенным мазком проводят 3-4 раза через пламя горелки той стороной, где нет мазка. При химическом способе мазки микробов фиксируют метиловым спиртом, этиловым спиртом, смесью этилового спирта и эфира в пропорции 1:1 и другими веществами погружением предметного стекла с мазком в жидкость на определенное время. Цель фиксации - убить клетки микроорганизмов и прикрепить их к стеклу. Мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Окрашивание мазка можно осуществить разными способами, которые делят на простые и сложные. При простом окрашивании препарата на охлажденный зафиксированный мазок наносят 2-3 капли раствора какой-либо краски. После окрашивания мазка в течение 30-60 с краску смывают струёй воды из промывалки.
Окрашенный препарат высушивают фильтровальной бумагой, прикладывая ее к мазку с обеих сторон. Микроскопируют окрашенный препарат в иммерсионной системе микроскопа. При сложных способах окрашивания применяют два или более красящих веществ. Эти способы эффективны при выявлении деталей строения микроорганизмов и их дифференциации.
Окраска по Граму имеет большое практическое значение для изучения микроорганизмов и их дифференциации.
Техника окрашивания по Граму.
1. На предметном стекле готовят фиксированный мазок (так же, как и для простой окраски).
2. На фиксированный мазок наносят 2-3 капли краски Грама (карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового) через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снимают, а краситель сливают и аккуратно смывают водой. Если имеется фильтровальная бумага, заранее подготовленная и пропитанная краской Грама, то ее накладывают на мазок и наносят 2-3 капли воды. Через 1-2 мин ее снимают и препарат аккуратно промывают водой.
3. Наносят 3-4 капли раствора Люголя и через 1 мин его сливают, не смывая водой.
4. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
5. Промывают препарат водой.
6. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
7. Микроскопируют препарат.
В результате окрашивания препарата по методу Грама одни виды бактерий (также дрожжи и актиномицеты) окрашиваются в фиолетовый цвет (Грам+), а другие в красный цвет (Грам-). В фиолетовый цвет окрашиваются те микроорганизмы, в цитоплазме и цитоплазматической мембране которых содержатся вещества, прочно связывающие краску Грама+ йод (из раствора Люголя). Клетки таких микробов не обесцвечиваются спиртом за 20-30 с. В красный цвет окрашиваются микроорганизмы, в цитоплазме которых нет веществ, прочно фиксирующих краску Грама+ йод. Такие клетки обесцвечиваются при обработке спиртом, поэтому окрашиваются фуксином Пфейфера.
Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в проницаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме. В клеточной стенке грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый (мукопептидный) слой, содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту. Пептидогликаны грамположительных бактерий структурно отличаются от грамотрицательных бактерий. Тейхоевые кислоты стабилизируют ионы магния на поверхности клеток. У грамположительных бактерий на поверхности клетки имеется комплекс протеин-рибонуклеат магния; соотношение РНК и ДНК в их цитоплазме составляет 8:1; у грамотрицательных бактерий это соотношение равно 1:1. Изоэлектрическая точка цитоплазмы у грамположительных бактерий находится при рН 2,0-3,0; у грамотрицательных - около 5,0. После обработки раствором йода, являющегося окислителем, происходит сдвиг изоэлектрической точки в кислую сторону, выраженный у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.
Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.
К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза и другие, к грамотрицательным - гонококки, менингококки, кишечная палочка и т. д. Некоторые виды бактерий могут окрашиваться по Граму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, изменяющих структуру клеточной стенки.
Основная ошибка, допускаемая при окраске по Граму, состоит в переобесцвечивании или недообесцвечивании мазка спиртом. В первом случае грамположительные бактерии могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Во втором случае грамотрицательные бактерии могут сохранять синефиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания. Микроскопируют препарат в иммерсионной системе.
Техника микроскопирования окрашенных препаратов
Особенностью микроскопирования окрашенных препаратов является следующее: препарат кладут на предметный столик так, чтобы мазок был на верхней стороне стекла; микроскопирование производят при наилучшем освещении поля зрения (конденсор поднят вверх до предела) с иммерсионным объективом 90.
При работе с иммерсионным объективом 90 на препарат наносят каплю иммерсионного масла, а затем с помощью микрометрического винта осторожно опускают тубус с центрированным объективом 90 так, чтобы его фронтальная линза погрузилась в каплю масла, фокус был ниже препарата (мазка). Затем, глядя в окуляр, тем же винтом очень медленно поднимают тубус (на сотые доли миллиметра), пока не увидят изображение микробов. Точную остановку препарата в фокус объектива производят с помощью микрометрического винта.
По окончании работы удаляют салфеткой из мягкой ткани иммерсионное масло с фронтальной линзы объектива 90, для более полного удаления масла фронтальную линзу протирают салфеткой, смоченной смесью спирта и эфира в пропорции 1:1, или экстракционным бензином, а затем протирают объектив досуха. Только после этого можно ставить микроскоп в шкаф или ящик для хранения.
Контрольные вопросы
1. Какое лабораторное оборудование используется для изучения морфологических свойств микроорганизмов?
2. Какова цель приготовления окрашенных препаратов?
3. Какие краски применяют для окраски бактерий?
4. Каков порядок приготовления препарата (мазка) для окрашивания?
5. Каковы сущность и техника окраски препаратов по методу Грама?
Оформление отчета
Отчет должен содержать:
1. Цель работы.
2. Наблюдаемую микроскопическую картину исследуемых препаратов окрашенных микроорганизмов.
Приложение А
К лабораторной работе № 2. Приготовление растворов красок, применяемых для окрашивания препаратов микроорганизмов
Для окрашивания мазков применяют растворы различных красок.
Карболовый фуксин Циля готовят смешиванием 100 мл 5 %-го раствора кристаллической карболовой кислоты и 10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина основного.
Фуксин Пфейффера готовят в день его использования; одну часть фуксина Циля смешивают с девятью частями дистиллированной воды.
Метиленовый синий (голубой) по Леффлеру: к 100 мл водного раствора КОН (0,01 %) добавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора металенового голубого (10 г краски на 100 мл 96 %-го этилового спирта).
Краску Грама готовят растворением 1 г генцианвиолета в 10 мл 96 %-го этилового спирта; полученный раствор добавляют к 100 мл 5 %-го раствора очищенной карболовой кислоты и после выдержки в течение 24 ч фильтруют.
Удобно пользоваться генцианвиолетом на бумажках (по Синеву); тонкие листы фильтровальной или газетной бумаги (на стекле) обливают 1-2 %-м спиртовым раствором этой краски, листы высушивают при температуре 18-20 °С и разрезают на прямоугольники 2x4 см. Хранят бумажки в банке с притертой пробкой.
Раствор Люголя: 2 г йодистого калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды, затем вносят 1 г йода и доводят объем дистиллированной водой до 300 мл.