ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ - Е.П. СУЧКОВА - 2016
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3
ИЗУЧЕНИЕ СТРОЕНИЯ И СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ
Цель занятия - ознакомиться с морфологическим составом и характеристиками микроорганизмов, применяемых в пищевой биотехнологии.
Ход работы. Выполняются задания:
Задание 1. Ознакомиться со свойствами микроорганизмов, применяемых в пищевой биотехнологии.
Задание 2. Ознакомиться с морфологическими особенностями чистых культур пропионовокислых, уксуснокислых микроорганизмов, бифидобактерий и дрожжей, применяемых при производстве пищевых продуктов, и маслянокислых микроорганизмов, используя простой метод окраски.
Задание 3. Ознакомиться с морфологическими особенностями чистых культур микроорганизмов и отношением к окраске по Граму содержащихся в исследуемой смеси бактериальных культур.
Выполнение лабораторной работы предусматривает опережающую теоретическую подготовку и использование учебно-методической литературы на занятии.
Теоретическое обоснование
Пропионовокислые бактерии. Пропионовокислые (Propionibacterium) бактерии - род грамположительных факультативных анаэробных неподвижных бактерий, синтезирующих в процессе метаболизма пропионовую кислоту. Propionibacterium обычно имеют вид палочек размером 0,5-0,8 на 1,0-1,5 мкм; реже, в зависимости от условий и цикла развития, - кокковидной, изогнутой или булавовидной формы. Propionibacterium размножаются бинарным делением и не образуют спор. Пропионовокислые бактерии являются возбудителями пропионовокислого брожения, при котором углеводы ферментируются с образованием главных продуктов брожения - пропионовой кислоты и ее солей - пропионатов. Кроме пропионовой кислоты, пропионовокислые бактерии продуцируют уксусную кислоту, углекислый газ и др. Propionibacterium обитают в желудочно-кишечном тракте жвачных животных, часто обнаруживаются в сыром молоке. Микроскопический препарат микроорганизмов представлен на рис. 3.
Рис. 3. Пропионовокислые бактерии
Большинство пропионибактерий не могут развиваться при значениях рН менее 5,0-4,5. Propionibacterium переносят лишь низкое парциональное давление кислорода. Оптимальная температура их развития 30-35 °С. Propionibacterium кроме сахаров и молочной кислоты способны сбраживать пировиноградную кислоту, глицерин и другие вещества. Ряд видов Propionibacterium способны продуцировать витамин B12. В микробиологической промышленности в качестве продуцентов витамина В12 используют штамм Propionibaderium Shermanii.
Пропионовокислые бактерии используют в сыроделии при производстве полутвердых сыров с высокой температурой второго нагревания. После окончания молочнокислого брожения в сырах начинается стадия развития пропионовокислых бактерий, сбраживающих молочную кислоту с образованием уксусной и пропионовой кислот и диоксида углерода. Летучие кислоты придают сырам специфический вкус и запах, а диоксид углерода участвует в формировании рисунка сыра.
Уксуснокислые бактерии. Уксуснокислые бактерии - грамотрицательные, палочковидные бесспоровые, строго аэробные организмы, развивающиеся в тех же условиях, что и дрожжи. К числу окисляемых соединений относятся одноатомные спирты, содержащие от 2 до 5 углеродных атомов, а также многоатомные спирты -
производные сахаров. Окисление первичных спиртов приводит к образованию кислот. Бактерии способны окислять этиловый спирт в уксусную кислоту, пропиловый спирт - в пропионовую кислоту, бутиловый спирт - в масляную кислоту. Некоторые виды бактерий способны окислять также глюкозу в глюконовую кислоту, ксилозу и арабинозу - в ксилоновую и арабановую кислоты. Этиловый спирт является главным источником жизнедеятельности уксуснокислых бактерий. Довольно требовательны к субстратам для роста. Почти все виды нуждаются в отдельных витаминах, в первую очередь в пантотеновой кислоте, но есть формы, способные к синтезу всех факторов роста. Микроскопический препарат микроорганизмов представлен на рис. 4.
Рис. 4. Уксуснокислые бактерии
Наиболее распространенные виды бактерий - Acetobacter aceti, Acet. Pasteurianium, Acet. oxydans. Они имеют форму палочек длиной 1-3 мкм, часто соединены в цепочки. Оптимальная температура для роста 20-35 °С. Acetobacter aceti выдерживает концентрацию спирта 10-11 %. Уксуснокислые бактерии часто развиваются вслед за дрожжами, используя продукт спиртового брожения как субстрат для роста. При накоплении в сбраживаемом сусле 0,01 % уксусной кислоты задерживается жизнедеятельность дрожжей, а при 0,2 % подавляется. Применяются в микробиологической промышленности для получения столового уксуса и в производстве аскорбиновой кислоты (на этапе окисления сорбита в сорбозу).
Бифидобактерии. Бифидобактерии (лат. Bifidobacterium: bifidus - разделенный надвое и bacteria - бактерия) - род грамположительных анаэробных бактерий, представляющих собой слегка изогнутые палочки длиной 2-5 мкм, иногда ветвящиеся на концах, спор и капсул не образуют. Оптимальная температура развития 37-41 °С, оптимальное значение рН 6-7, при рН ниже 4,5 и выше 8,5 рост микроорганизмов прекращается. Для размножения бифидобактерий необходимы значительные количества факторов роста. Многие виды нуждаются в биотине, пантотеновой кислоте, цистеине, рибофлавине, пуриновых и пиримидиновых основаниях, пептидах, аминосахарах, коферменте А, олигосахаридах, некоторых ненасыщенных жирных кислотах и др. Отдельные штаммы нуждаются в углекислом газе, аммиаке, гистидине. Из аминокислот требуются лизин, пролин, серин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Некоторые штаммы бифидобактерий растут при наличии азотфиксирующих олигосахаридов - N-ацетил-глюкозамина, N-ацетил-галактозамина, N-ацетил-маннозамина и др., которые отсутствуют в коровьем молоке (содержатся в женском молоке).
В синтетических средах бифидобактериям для роста необходимы железо, магний, фосфаты, хлориды калия и натрия, в некоторых случаях - марганец. Бактерии составляют 80-90 % кишечной флоры детей, находящихся на грудном вскармливании, и молодняка млекопитающих в подсосном периоде. Микроскопический препарат микроорганизмов представлен на рис. 5.
Рис. 5. Бифидобактерии
Присутствие бифидобактерий в кишечнике полезно для ребенка и молодых животных, так как бифидобактерии подавляют развитие различных гнилостных и болезнетворных микроорганизмов. По окончании молочного вскармливания бифидофлора сменяется обычной кишечной микрофлорой, характерной для взрослых организмов. Живые бифидобактерии обладают высокой антагонистической активностью против широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов кишечника (включая стафилококки, протей, энтеропатогенную кишечную палочку, шигеллы, некоторые дрожжеподобные грибы); восстанавливают равновесие кишечной микрофлоры; нормализуют пищеварительную и защитную функции кишечника; активизируют обменные процессы; повышают неспецифическую резистентность организма.
В молоке бифидобактерии развиваются медленно, так как коровье молоко не является естественной средой их обитания. Одной из причин плохого роста бифидобактерий в молоке служит растворенный в нем кислород. Рост бифидобактерий в коровьем молоке стимулируют экстракты дрожжей, гидролизованное молоко, а также увеличение соотношения белок: лактоза. Сильный стимулирующий эффект роста бифидобактрии получают при использовании гидролизатов казеина. Растительными стимуляторами роста бифидобактерий в молоке являются обезжиренная соя, экстракт картофеля, тростниковый сахар, кукурузный экстракт, морковный сок. В качестве стимуляторов роста применяют также соли железа, сорбит, микроэлементы в виде сернокислой меди и лактата железа.
Бифидобактерии в процессе жизнедеятельности вырабатывают ряд органических кислот. В основном это уксусная и молочная кислоты (в молярном отношении 3:2), а также муравьиная и янтарная. Бифидобактерии синтезируют аминокислоты, белки, витамины В1, В2 (рибофлавин), В6 (пиридоксин), В12, викасол, никотиновую и фолиевую кислоты.
Бифидофлора человека представлена пятью видами: B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. breve и B. infantis. Первые три вида встречаются в биоценозе кишечника с наибольшей частотой - в 39-75 % случаях. Виды B. breve и B. infantis обнаруживаются реже - в 16-36 % случаях и только у детей грудного возраста. Поскольку эти виды свойственны детям раннего возраста, то и использование одного из них, Bifidobacterium breve, при разработке препаратов-эубиотиков на его основе весьма перспективно. Положительные эффекты бифидобактерий позволили в свое время рассматривать эти микроорганизмы как эффективный биокорректор и основу для создания препаратов, обладающих многофакторным регулирующим и стимулирующим воздействием на организм, а также как одну из основных категорий функционального питания.
Маслянокислые бактерии. Маслянокислые бактерии относятся к сахаролитическим клостридиям; строгие анаэробы, имеющие подвижные крупные спорообразующие, грамположительные палочки длиной до 10 мкм. Споры их цилиндрической или эллипсоидальной формы, похожи на теннисную ракетку. Наряду с масляной кислотой они могут образовывать (в меньших количествах) уксусную, молочную, капроновую, каприловую и другие кислоты, а также этиловый и бутиловый спирты. Возбудители этого брожения развиваются главным образом в трубопроводах, насосах и других скрытых местах. Оптимальная температура для роста бактерий 30-40 °С, при рН ниже 4,9 они не развиваются. Наиболее распространены следующие виды маслянокислых бактерий: Клостридиум бутирикум (Clostridium butyricum), Клостридиум ацетобутиликум (Clostridium acetobutylicum), Clostridium pasteurianum, Clostr. saccharobutyricum. Микроскопические препараты микроорганизмов представлены на рис. 6.
Рис. 6. Маслянокислые бактерии
Маслянокислые бактерии опасны для спиртового производства, так как вырабатываемая ими масляная кислота даже в очень малых концентрациях (0,0005 %) подавляет развитие дрожжей. Особенно опасно маслянокислое брожение в производстве сыра, так как оно вызывает порок «позднее вспучивание» сыров. Борьба с маслянокислыми бактериями затруднена тем, что при тепловой обработке молока не уничтожаются споры маслянокислых бактерий.
Возбудителями порока «позднее вспучивание» в сыроделии являются масляно-кислые бактерии Clostridium tyrobutyricum, которые развиваются в созревающем сыре после прекращения молочнокислого процесса и повышения рН сыра вследствие накопления продуктов белкового распада при его созревании.
Маслянокислые бактерии попадают в сыр с молоком при кормлении коров некачественным силосом. Споры полностью выдерживают высокотемпературную кратковременную обработку и при пастеризации молока-сырья не погибают. Они прорастают в сырах и могут расти при температуре выше 7 °С в анаэробных условиях, продуцируя главным образом масляную кислоту, СО2 и Н2 путем расщепления молочной кислоты. Для позднего вспучивания характерны: неправильный, щелевидный рисунок сыра; размягченная, губчатая консистенция; резкий запах масляной кислоты; неприятный сладковатый и даже салистый вкус. Основной путь предупреждения вспучивания сыров состоит в соблюдении чистоты при получении молока на ферме. Применяют также специально подобранные антагонистические закваски.
Методические указания
Оборудование и материалы: биологические объекты, микроскоп, предметные стекла, иммерсионное масло, бактериологические петли, фильтровальная бумага, покровные стекла, спиртовки, растворы основных красок: фуксин Пфейффера, краска Грама, раствор Люголя, раствор метиленовой сини, вода дистиллированная, спирт 96 %.
Подготовить препараты чистых культур пропионовокислых, уксуснокислых микроорганизмов, маслянокислых и бифидобактерий, дрожжей в соответствии с методикой (см. лабораторную работу № 2).
Ознакомиться с морфологическими особенностями микроорганизмов, используя простой метод окраски. Зарисовать микроскопическую картину.
Подготовить препараты смеси бактериальных культур и окрасить по Граму в соответствии с методикой (см. лабораторную работу № 2). Определить отношение к окраске по Граму содержащихся в исследуемой смеси микроорганизмов. Зарисовать микроскопическую картину. Сделать выводы.
Контрольные вопросы
1. Назовите основные виды бактерий и их использование в пищевой биотехнологии.
2. Назовите морфологические особенности культур пропионовокислых бактерий и бифидумбактерий.
3. Как характеризуются исследуемые виды чистых культур микроорганизмов по отношению к краске Грама?
Оформление отчета
Отчет должен содержать:
1. Цель работы.
2. Описание одного вида микроорганизмов из списка, используемых в промышленности для получения целевых продуктов.
3. Наблюдаемую микроскопическую картину исследуемых микроорганизмов.
4. Выводы.