ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ - Е.П. СУЧКОВА - 2016
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4
ИЗУЧЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК И СПОСОБОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель работы - изучить биотехнологические характеристики молочнокислых бактерий и их применение в пищевой биотехнологии на примере йогуртовой и ацидофильной заквасок.
Ход работы. Выполняются задания:
Задание 1. Ознакомиться с биотехнологическими характеристиками молочнокислых микроорганизмов.
Задание 2. Ознакомиться с составом и свойствами заквасок: йогуртовой, ацидофильной, для производства сметаны и сыров.
Задание 3. Приготовить препараты заквасок и исследовать их состав.
Теоретическое обоснование
Молочнокислые бактерии широко распространены в природе. По морфологическим признакам их делят на стрептококки и палочки. В каждой группе имеются гомо- и гетероферментативные бактерии.
Молочнокислые стрептококки. Молочнокислые стрептококки относятся к семейству Streptососсасеае, родам Lactococcus и Leuconostoc. К гомоферментативным относятся молочный (Lactococcus lactis) и сливочный (Lactococcus cremoris) стрептококки. Гетероферментативными являются ароматобразующие стрептококки, способные продуцировать ароматические вещества (диацетил, ацетоин) и усваивать соли лимонной кислоты - цитраты. В эту группу входят Lactococcus diacetylactis, Leuconostoc cremoris, Leuconostocdextranicum. Промежуточное положение между гомоферментативными и гетероферментативными стрептококками занимает термофильный стрептококк Str. thermophilus.
Молочнокислые стрептококки представляют собой шаровидные или овальные клетки размером до 1-2 мкм, располагающиеся в виде коротких цепочек или попарно; неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму красятся положительно. В молодых культурах некоторые штаммы сливочного стрептококка образуют слизистую
капсулу. Клетки ароматобразующих стрептококков несколько мельче, чем клетки Lactococcus lactis и Lactococcus cremoris, а клетки термофильного стрептококка крупнее, чем сливочного.
Молочнокислые стрептококки по отношению к кислороду являются факультативными анаэробами, т. е. растут не только в анаэробных условиях, но и при доступе молекулярного кислорода. Однако в присутствии кислорода у них не изменяется тип дыхания, так как не проявляется аэробное дыхание, а продолжается процесс брожения. Поэтому молочнокислые бактерии можно отнести к категории аэротолерантных (воздухотерпимых) анаэробов.
Температурные границы жизнедеятельности этих микроорганизмов довольно широки. Для мезофильных видов оптимальная температура составляет 25-30 °С, для термофильных - 38-43 °С. Минимальной температурой развития для мезофильных молочнокислых бактерий являются 10 °С, для термофильных - 20-22 °С. Некоторые молочнокислые бактерии способны расти при очень низких плюсовых температурах (до 3 °С). По потребности в питательных веществах молочнокислые бактерии относятся к наиболее сложным микроорганизмам. В качестве источника углерода они могут использовать моно- и дисахариды, органические кислоты.
Большинству видов молочнокислых бактерий для развития необходимы аминокислоты: аргинин, цистеин, глутаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, триптофан, тирозин, валин. Только некоторые виды молочнокислых стрептококков могут расти на средах, содержащих аммонийные соли в качестве единственных источников азота.
Большинству молочнокислых бактерий необходимы витамины - рибофлавин (В2), тиамин (В1), пантотеновая (В3), никотиновая (РР), фолиевая (В9) кислоты, пиридоксин (В6) и др. Этим объясняется положительное влияние на рост микроорганизмов добавок к питательным средам различных экстрактов (кукурузы, моркови, картофеля), дрожжевого автолизата и других витаминосодержащих соединений. Рост молочнокислых бактерий стимулируют и некоторые пептиды, пурины (аденин, гуанин, гипоксантин), пиримидины (урацил, тимин и др.), жирные кислоты (уксусная, олеиновая), а также лимонная кислота. Молочнокислые бактерии культивируют на обезжиренном стерильном молоке или на плотных и жидких искусственных питательных средах с использованием гидролизованного молока и других питательных веществ, получаемых из молока.
Развитие молочнокислых стрептококков в молоке вызывает его свертывание (за исключением Leuconostoc demons) с образованием ровного, без обильного отделения сыворотки плотного сгустка, имеющего приятные кисломолочные вкус и запах. Ароматобразующие стрептококки образуют сгусток, в котором можно обнаружить в небольшом количестве пузырьки углекислого газа. На питательной среде (агар с гидролизованным молоком и мелом) молочнокислые стрептококки образуют мелкие (0,5-1 мм) каплевидные колонии с ровным краем, с зонами просветления мела. Колонии в толще питательной среды (глубинные колонии) имеют форму лодочки или зерна чечевицы. Lactococcus diacetilactis на 3 %-м агаре может образовывать глубинные колонии в виде паучков или комочков ваты, похожих на колонии молочнокислых палочек.
Молочнокислые бактерии растут в средах с низким значением рН - от 5,5 до 8,8. Характерным свойством молочнокислых бактерий является высокая спиртоустойчивостъ. Они могут развиваться на питательных средах, содержащих 15-18 % этилового спирта, реже - при 24 %. Биохимические свойства молочнокислых бактерий изучают по энергии кислотообразования, предельной кислотности, способности сбраживать соли лимонной кислоты, по качеству сгустка, возможной протеолитической активности бактерий и др. Энергию кислотообразования определяют по времени образования сгустка молока (кислотность около 60 °Т) при внесении 0,5 см3 молодой (12-20-часовой) культуры в 10 см3 стерильного обезжиренного молока и выращивании посевов при оптимальной температуре.
Протеолитическую активность бактерий изучают на мясопептонном желатине, молоке или определяют с помощью специальных биохимических исследований и судят о ней по общему количеству образовавшихся водорастворимых продуктов распада белка, образованию аммиака, сероводорода, индола, которые характеризуют глубокий распад белковых веществ. Способность сбраживать соли лимонной кислоты (цитраты) определяют посевом бактерий на плотную среду с цитратом кальция. Появление зон просветления вокруг колоний свидетельствует об образовании водорастворимых продуктов брожения при наличии фермента цитритазы. Активность образования ароматических веществ устанавливают по количеству образовавшихся летучих соединений (методом возгонки) и четырехуглеродных соединений (диацетила и ацетоина). Молочнокислые стрептококки обладают различной активностью.
Lactococcus lactis является первым микроорганизмом, который выделен в чистой культуре (в 1873 г. Листером). Lactococcus lactis (рис. 7) встречается на растениях, с пылью и растительными частицами попадает на доильное оборудование, а затем в молоко. Он встречается в виде коротких цепочек из двух-шести звеньев. Оптимальная температура развития около 30 °С. Отдельные штаммы Lactococcus lactis могут медленно размножаться при низких температурах (ниже 7 °С). При температуре 25 °С за счет образования молочной кислоты показатель рН снижается примерно до 4,5 и молоко свертывается вследствие кислотной коагуляции казеина. Lactococcus lactis является активным кислотообразователем.
Рис. 7. Lactococcus lactis
Активные штаммы свертывают молоко за 4-7 ч, Предельная кислотность при его развитии достигает 120 °Т. Не развивается в среде, содержащей 6,5 % NaСl, и в щелочной среде при рН 9,5. Многие штаммы продуцируют антибиотик низин, который является полипептидом с молекулярной массой 3500. Он подавляет большинство стрептококков (но не энтерококков), стафилококков, микрококков, некоторые виды бацилл, лактобактерий, клостридий, актиномицетов. При этом в отношении грамотрицательных бактерий низин бактерицидным действием не обладает.
Lactococcus cremoris (рис. 8) в отличие от молочного стрептококка не сбраживает мальтозу и декстрин, лишен способности дезаминировать аргинин. Не растет на средах, содержащих 4 % КСl, а также при температуре 39-40 °С. При пониженных температурах культивирования (15-20 °С) некоторые штаммы образуют значительное количество летучих кислот. Имеются слизеобразующие штаммы, формирующие сгустки молока при температуре 10-18°С. Их используют в заквасках для производства сметаны. Энергия кислотообразования у Lactococcus cremoris слабее, чем у Lactococcus lactis, и составляет 6-8 ч, предельная кислотность 110-115 °Т. образует длинные цепочки. Оптимальная температура развития Lactococcus cremoris 20-25 °С. В течение 24 ч при этой температуре наблюдается свертывание молока при значении рН, равном 5,0-5,2.
Рис. 8. Lactococcus cremoris
В заквасках Lactococcus cremoris в сочетании с Lactococcus lactis способствует образованию более густой консистенции продукта.
Ароматобразующие стрептококки Lactococcus diacetylactis, выделяют фермент цитритазу, которая расщепляет цитраты с образованием диоксида углерода и ароматических веществ - ацетоина и диацетила. Сравнительно слабый кислотообразователь, но образует диацетил в значительном количестве. Имеет слабую энергию кислотообразования (более 16 ч), предельная кислотность в молоке достигает 70-100 °Т. Сгусток молока часто содержит пузырьки газа (СО2). При созревании сыров СО2 участвует в формировании рисунка сыра, в образовании глазков в сырной массе. При развитии Lactococcus diacetylactis в молоке сгусток приобретает специфический приятный запах и аромат, обусловленные накоплением диацетила. Ацетоин не обладает выраженным ароматом, но тесно связан с диацетилом. Для образования диацетила необходима лимонная кислота. Поэтому обогащение питательной среды лимонной кислотой способствует продуцированию ароматического вещества. Оптимальной температурой ароматообразования являются 25 °С. Многие штаммы разлагают аргинин с выделением аммиака, устойчивы к содержанию в среде 4 % NaCl. Штаммы Lactococcus diacetylactis вводят в состав заквасок для творога, сметаны, простокваши обыкновенной.
Leuconostoc dextranicum является также слабым кислотообразователем. Он свертывает молоко при оптимальной температуре через 2-3 суток. Предельная кислотность составляет 70-80 °Т. Оптимальная температура кислотообразования 18-20 °С при низком значении рН (менее 6), т. е. при накоплении молочной кислоты в процессе брожения. Часто входит в состав заквасок для сыров.
Leuconostoc cremoris молоко не свертывает, предельная кислотность 40-50 °Т. Входит в состав заквасок для производства кисло-сливочного масла и способствует сохранению аромата при его хранении.
Для развития Leuconostoc dextranicum и Leuconostoc cremoris большое значение имеет марганец, повышенное содержание которого в молоке в летне-осенний период стимулирует их рост и ароматообразование. Штаммы молочнокислых стрептококков: L. lactis, L. cremoris, Leu. cremoris, L. diacetylactis, Leu.dextranicum входят в состав заквасок для производства творога, сметаны, простокваши обыкновенной, кислосливочного масла, сыров.
Streptococcus thermophilus (рис. 9) по энергии кислотообразования превосходит все молочнокислые стрептококки, достигая уровня термофильных лактобактерий. Он сквашивает молоко через 3,5-6 ч, предельная кислотность составляет 110-115 °Т. Термофильный стрептококк не растет на средах пенициллина 0,01 МЕ/см3 и стрептомицина 5 мкг/см3, что используют в качестве тест-культуры при выявлении антибиотиков в молоке. Чувствителен к действию специфических бактериофагов. Более интенсивный рост термофильных стрептококков наблюдается при добавлении к питательным средам основных аминокислот: валина, леицина, изолейцина, лизина, аргинина, метионина, гистидина и пролина.
Рис. 9. Streptococcus thermophiles
S. thermophilus обладает относительно высокой термоустойчивостью. Он выдерживает температуру 75 °С в течение 15 мин и 65 °С в течение 30 мин, вследствие чего составляет значительную часть остаточной микрофлоры в молоке после пастеризации. В жидкой среде, содержащей глюкозу и 4 % NaCl, термофильный стрептококк кислоту не образует, а при содержании 2 % MgCl2 молочную кислоту синтезируют отдельные штаммы. При наличии в среде 0,1 % метиленового голубого S. thermophilus не развивается. Некоторые штаммы образуют диацетил, в небольшом количестве синтезируют ацетоин.
Молочнокислые палочки. Молочнокислые палочки (лактобактерии) относят к семейству Lactobacteriaceae, роду Lactobacterium, включающему три подрода: Thermobacterium,Streptobacterium и Betabacterium. Термобактерии и стрептобактерии являются гомоферментативными, а бета-бактерии - гетероферментативными молочнокислыми палочками.
К термобактериям относятся 8 видов палочек, среди которых наиболее часто применяют Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricum, L. lactis. Длинные палочки, не образуют цепочек, при температуре ниже 15 °С не развиваются, оптимальный рост при температуре около 40 °С, гомоферментативные.
Подрод стрептобактерии включает 7 видов, среди которых в молочной промышленности используют L. plantarum и L. rhamnosus. Образуют длинные цепочки, состоящие из коротких палочек, развиваются и при температуре ниже 15 °С, оптимальный рост при температуре 30 °С, гомоферментативные.
В подрод бета-бактерий входят 11 видов палочек, наиболее изученными среди них являются L. brevis, L. buchneri, L. fermentum. Гетероферментативные.
Лактобактерии представляют собой палочки, одиночные или соединенные попарно, размером (4...10) х (0,5...0,6) мкм. Они неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму красятся положительно. Клетки стрептобактерии мельче, чем клетки термобактерий, и часто располагаются в виде цепочек. Бета-бактерии имеют наиболее мелкие и тонкие клетки.
Молочнокислые палочки являются факультативными анаэробами или микроаэрофилами. По отношению к температуре стрептобактерии и бета-бактерии являются мезофилами, термобактерии - термофилами. На обычных средах они не растут, их выращивают на средах с молоком. При развитии в молоке вызывают образование однородного плотного сгустка с приятными кисломолочными запахом и вкусом.
На плотной питательной среде лактобактерии формируют мелкие гладкие блестящие колонии со сферической поверхностью серо-белого цвета. Колонии лактобактерий разных видов почти не различаются. Однако в некоторых случаях наблюдаются волокнистые, врастающие в субстрат колонии R-формы в отличие от гладких колоний, относящихся к S-формам. Глубинные колонии термобактерий могут быть темными, желтовато-бурыми, иногда с короткими отходящими нитями. В отличие от глубинных колоний поверхностные колонии более крупные, локонообразные или зернистые. Глубинные колонии стрептобактерий имеют лодочкообразную форму, иногда с выростом.
Температурные границы роста для термобактерий составляют 20-55 °С, для мезофилов - 15-38 °С. Оптимально температурой развития для L. helveticus являются 40 °С, для L. bulgaricus, L. Lactis - 45 °С, L. acidophilus - 37-38 °С. Для мезофилов оптимальной является температура 30 °С.
Лактобактерии обладают слабой протеолитической активностью, поэтому не растут в субстратах, где единственным источником азота является белок, т. е. где отсутствуют различные аминокислоты. В то же время имеются молочнокислые бактерии, которые могут расщеплять белки.
Молочнокислые бактерии не восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют пигментов. Цитохромы и пероксидазу не образуют, но некоторые продуцируют каталазу, разлагающую пероксид водорода (Н2О2). Лактобактерии обладают хорошо выраженными сахаролитическими свойствами. Кроме глюкозы и лактозы они сбраживают и другие сахара. Так, многие гомо- и гетероферментативные виды (L. plantarum и L. brevis и др.) интенсивно используют пентозы, иногда даже активнее, чем глюкозу.
Гетероферментативные молочнокислые бактерии сбраживают фруктозу, поскольку у них имеется маннитдегидрогеназа, осуществляющая восстановление фруктозы до маннита. Продуктами сбраживания фруктозы также являются лактаты, ацетаты и углекислый газ.
Термофильные молочнокислые палочки являются активными кислотообразователями, они сквашивают молоко через 4-5 ч, предельная кислотность достигает 200-350 °Т,Lactobacillus helveticus (рис. 10) является самым активным кислотообразователем, предельная кислотность молока при его развитии достигает 350 °Т. Эта палочка сбраживает мальтозу и декстрин, не сбраживает сахарозу, раффинозу, салицин. Некоторые штаммы развиваются в субстратах, содержащих до 5 % поваренной соли. Штаммы L. helveticum можно выделить из сычуга телят или кислого сырого молока. Используется вместе с Streptococcus thermophilus для приготовления эмментальского и грюйерского сыров. Не только образует молочную кислоту, но и участвует, благодаря наличию протеолитического эндофермента, в созревании сыров. Ее использование придает сыру выраженный пряный вкус.
Рис. 10. Lactobacillus helveticus
Lactobacillus bulgaricus (рис. 11) образует длинные палочки и является гомоферментативной, доводит предельную кислотность молока до 200-300 °Т. Штаммы болгарской палочки образуют ацетальдегид - ароматическое вещество, придающее специфические вкус и запах, и антибиотические вещества, подавляющие нежелательную микрофлору кишечника. Болгарская палочка чувствительна ко многим антибиотикам, устойчива к бактериофагу. Штаммы L. bulgaricus выделяют, как правило, из сырого молока. Совместно с Streptococcusthermophilus она применяется для приготовления йогурта.
Рис. 11. Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus входит в состав заквасок для приготовления многих кисломолочных продуктов, таких как мечниковская простокваша, айран, кумыс, напитки «Снежок» и «Южный». Ее используют также в составе специально разработанных заквасок для производства итальянских мягких сыров (Горгонзола Дольче и Горгонзола Пиканта), итальянских вытяжных сыров семейства Паста Филата (Моцарелла, Качокавалло, Проволоне, Сулугуни), для производства швейцарского сыра Грюйер с высокой температурой второго нагревания.
L. acidophylus (рис. 12) является кишечным микробом, который можно выделить из содержимого пищеварительного тракта человека и различных животных. Ацидофильная палочка способна после культивирования в молоке вновь приживаться в кишечнике человека и подавлять там развитие патогенных и нежелательных микроорганизмов (сальмонеллы, шигеллы, стафилококки, эшерихии и др.). Антагонистическое действие L. acidophylus обусловлено продуцируемыми антибиотиками — ацидофилином и лактоцидином.
Рис. 12. Lactobacillus acidophilus
Ацидофильные бактерии устойчивы к щелочной реакции (рН 8,3), наличию в среде фенола (0,25-0,4 %), желчи (20 %), КСl (2 %). Предельная кислотность ацидофильной палочки достигает 200-250 °Т. L. acidophylus сбраживает сахарозу, мальтозу, салицин, часто раффинозу, декстрин. Имеются слизеобразующие штаммы ацидофильной палочки.
Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis (L. Lactis) по своим свойствам и поведению в закваске проявляют большое сходство с L.bulgaricus. Сбраживают глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, раффинозу, декстрин и салицин. Предельная кислотность молока, сквашенного L. lactis, достигает 120-180 °Т. В результате жизнедеятельности палочек происходит интенсивное кислотообразование, обусловливающее порок творога, сметаны, обыкновенной простокваши, - излишне кислотный вкус. Могут вызывать тягучесть и нечистый, неприятный вкус.
Стрептобактерии (рис. 13) обладают хорошо выраженными сахаролитическими свойствами. Они сбраживают фруктозу, галактозу, маннит, маннозу, раффинозу, рибозу, салицин, сорбит, трегалозу, эскулин и др. Глюкозу сбраживают без образования газа.
Рис. 13. Стрептобактерии: а - Lactobacillusplantarum; б - Lactobacillus casei
Лактобактерии продуцируют ряд гидролитических ферментов, в частности лактазу, расщепляющую лактозу (молочный сахар) и препятствующую развитию лактазной недостаточности. Лактобактерии поддерживают кислотность толстой кишки на уровне 5,5-5,6 рН.
Лактобактерии казеи (Lactobacillus casei) - вид грамположительных палочкообразных анаэробных неспорообразующих бактерий. Lactobacillus casei - нормальный резидент ротовой полости, кишечника.
Бактерии видов Lactobacillus casei и plantarum являются гомоферментативными и сбраживают лактозу с преимущественным образованием молочной кислоты. В молоке развиваются медленно, предельная титруемая кислотность 80-180 °Т. Мезофильные лактобациллы обладают сравнительно низкой терморезистентностью: они не выдерживают нагревания при 60 °С в течение 10 мин. Однако часть популяции выдерживает кратковременную пастеризацию при 72 °С и немного выше. Lactobacillus casei subsp. casei (сырная палочка) постоянно обнаруживается в различных сырах, особенно на поздних стадиях созревания последних. В молочной культуре популяция этого вида представлена слегка изогнутыми палочками толщиной 0,3-0,9 мкм и длиной 0,8-4,0 мкм, расположенными одиночно, парами или в виде цепочек. Характерной особенностью Lactobacillus casei subsp. caseiявляется способность образовывать цепочки с разным количеством клеток. Lactobacillus casei отличается от Lactobacillus plantarum способностью образовывать газ из цитрата натрия. Оптимальная температура роста 30-32 °С, минимальная - 10 °С, максимальная - 45 °С.
Lactobacillus plantarum используется в составе микрофлоры антагонистических заквасок и для производства пробиотических напитков, так как является представителем резидентной микрофлоры кишечника. В морфологическом плане микроорганизмы этого вида чрезвычайно изменчивы. Они представляют собой палочки с закругленными концами толщиной от 0,5 до 1,0 мкм и длиной от 0,6 до 8 мкм; располагаются поодиночке, парами или в виде коротких цепочек. Размер палочек и расположение зависят от индивидуальных свойств штаммов, фазы развития культуры, состава питательных сред, условий выращивания.
Штаммы, используемые в составе заквасок и концентратов для сыров с низкими температурами второго нагревания, обычно состоят из клеток, по форме приближающихся к коккам (длиной 0,8-3,0 мкм; толщиной 0,5-0,6 мкм). При развитии в молоке значительным изменениям подвержена длина клеток. В частности, в благоприятных условиях роста популяции клетки Lactobacillus plantarum представлены в основном короткими палочками, нередко располагающимися парами и реже в цепочках по три клетки; при ухудшении условий (например, в кислых средах, что наблюдается при длительной выдержке заквасок) в микропрепарате преобладают длинные клетки. Оптимальная температура роста 30-32 °С, минимальная - 10 °С, максимальная - 45 °С. Lactobacillus plantarum обладает специфической антагонистической активностью к маслянокислым бактериям. Исследования природы антагонизма показали, что данные культуры образуют в средах перекись водорода в концентрациях, ингибирующих или подавляющих развитие споровых анаэробных бактерий. В нашей стране закваски, содержащие Lactobacillus plantarum со специфической антагонистической активностью к маслянокислым и энтеробактериям, широко применяются в промышленности с начала 1970-х годов и получили высокую оценку производственников. В настоящее время биологические методы борьбы с вредной для сыроделия микрофлорой появились и за рубежом (так называемые защитные культуры). Мезофильные гомоферментативные лактобациллы нечувствительны к бактериофагам лактококков. Они стимулируют развитие лактококков в совместных культурах, поэтому включение в концентраты специально отобранных штаммов мезофильных лактобацилл, заведомо не образующих пороки в сырах, может в определенной степени повысить стабильность молочнокислого брожения при выработке сыра, что является необходимым условием получения сыров высокого качества.
Lactobacillus rhamnosus (Лактобактерии рамнозус) - вид грамположительных анаэробных неспорообразующих бактерий. Раньше Lactobacillus rhamnosus как подвид относился к виду Lactobacillus casei, однако по современной систематике Lactobacillus rhamnosus считается отдельным видом рода Лактобактерии.
Стрептобактерии обладают менее выраженной кислотообразующей способностью. Они сквашивают молоко через 2-3 суток, предельная кислотность составляет 180°Т. Стрептобактерии L. plantarum, L. rhamnosus способны усваивать кроме лактозы также соли молочной кислоты, т. е. лактаты. Они растут в гидролизованном молоке, содержащем 6 % МаСl и 20-40 % желчи, восстанавливают и свертывают лакмусовое молоко и не образуют аммиак из аргинина. Обладают высокой протеолитической активностью (в 2 раза выше, чем у мезофильных молочнокислых стрептококков), содержание свободных аминокислот в молоке повышают с 10 до 60 мг %. L. rhamnosum в отличие от L. plantarum образует СО2 из цитрата натрия. L. plantarum продуцирует пероксид водорода и синтезирует бактериоцин плантарицин, действующий угнетающе на кишечную микрофлору и маслянокислые бактерии. Бактериоцины - вещества белковой природы, продуцируемые бактериями многих видов, угнетающие развитие родственных микроорганизмов. Lactobacillus plantarum используется в составе заквасок для приготовления силоса, квашеной капусты, сыров с низкой температурой второго нагревания.
Lactobacillus casei используются в различных БАДах и продуктах для придания им пробиотических свойств. На российском рынке кисломолочных продуктов наиболее известны Actimel компании Данон, содержащие штамм Lactobacillus casei Imunitass (или штамм DN-11400) и Imunele компании Вимм-Билль-Данн. За рубежом широко применяется штамм Lactobacillus casei Shirota (кисломолочный напиток Yakult), штаммы F19 (продукт Cultura фирмы Arla Foods), CRL431 (продукты фирмы Chr. Hansen).
К группе бета-бактерий (рис. 14) относятся Lactobacillus brevis, L. buchneri и L. fermenti. В молочных продуктах чаще встречается L. brevis. По виду и расположению клеток эти микроорганизмы не различаются. Клетки их представляют собой мелкие палочки. На поверхности плотных питательных сред они образуют круглые по форме колонии. Бета-бактерии являются очень слабыми кислотообразователями, они не свертывают молоко. Температурный оптимум их роста составляет 30°С. При добавлении дрожжевого автолизата рост бактерий значительно усиливается и кислотность достигает 150-160 °Т. По своим свойствам они близки к аромато-образующим стрептококкам. Бета-бактерии растут при 15 °С и не растут при 48 °С, некоторые виды бета-бактерий не растут даже при 45 °С. Бета-бактерии образуют аммиак из аргинина и углекислый газ из глюкозы. Этими свойствами они отличаются от других молочнокислых палочек. Бета-бактерии не свертывают лакмусовое молоко и лишь частично его восстанавливают (порозовение). Они могут развиваться в среде, содержащей 4 % NaCl. Бета-бактерии имеют низкую терморезистентность. Входят в состав микрофлоры кефирных грибков.
Рис. 14. Бета-бактерии: а - Lactobacillus fermentum; б - Lactobacillus brevis
Lactobacillus fermentum является грамположительным видом бактерий в роду Lactobacillus. Отличительная особенность этого вида заключается в том, что температурный оптимум роста у него значительно выше - в пределах 37-40 °С. При 15 °С рост не наблюдается. Вид L. fermenti часто встречается в заквасках и, по-видимому, является специфичным для хлебопекарного производства.
Исследование антиоксидантных свойств штамма показало, что он может предотвратить порчу мягких сырных продуктов. Эксперименты, проведенные путем введения штамма Lactobacillus fermentum в молочные продукты как пробиотического компонента, показали, что он был в состоянии подавить предполагаемых загрязнителей пищевых продуктов, таких как патогенные Salmonella SPP, Shigella SPP.
Lactobacillus buchneri - грамположительные, неспорообразующие, анаэробные. L.buchneri являются гетероферментативными бактериями, обладающими наибольшей антагонистической активностью против дрожжей и плесневых грибов. Они способны наряду с молочной продуцировать значительное количество уксусной кислоты в процессеферментации, что улучшает аэробную стабильность силоса. Исследованиями выявлено, что Lactobacillus buchneri подавляют нежелательную микрофлору и эффективно борются с накоплением микотоксинов.
Общие методы идентификации молочнокислых бактерий
Для идентификации молочнокислых бактерий используют морфологические, культуральные и биохимические методы. Существуют также общие методы, которые учитывают биохимические отличия в обмене веществ и химическом составе клеток. В частности, молочнокислые бактерии можно идентифицировать по способности к сбраживанию углеводов и спиртов, а также по потребности в витаминах, необходимых для роста бактерий. S. thermophilus в отличие от других гомоферментативных молочнокислых стрептококков сбраживает, как правило, сахарозу. Более широким спектром сбраживания углеводов обладают гетероферментативные молочнокислые стрептококки, лейконостоки и мезофильные молочнокислые палочки, стрептобактерии и бета-бактерии. Имеются различия в сбраживании углеводов и у термофильных молочнокислых палочек. Считается, что L. bulgaricusсбраживают мальтозу. Однако отмечена способность сбраживать мальтозу и у штаммов L. acidophilus, которая зависит от активности их кислотообразования: она более выражена у слабых по кислотообразованию штаммов. Способность молочнокислых бактерий к сбраживанию углеводов сильно варьирует при изменении условий культивирования. Поэтому данный признак рассматривают как вспомогательный. При идентификации молочнокислых бактерий учитывается также их потребность в витаминах. Этот признак тоже может быть полезным лишь при очень тщательном проведении экспериментов на строго определенных питательных средах и при стандартных условиях. Для идентификации молочнокислых бактерий в качестве таксономического признака используется специфичное для каждого вида содержание гуанина и цитозина (Г+Ц), которое измеряется в процентах от общего содержания оснований в ДНК клетки.
Методические указания
Оборудование и материалы: биологические объекты, микроскоп, предметные стекла, иммерсионное масло, бактериологические петли, фильтровальная бумага, покровные стекла, спиртовки, растворы основных красок: фуксин Пфейффера, краска Грама, раствор Люголя, раствор метиленовой сини, вода дистиллированная, спирт 96 %.
Подготовить препараты заквасок: йогуртовой, ацидофильной, для сметаны и производства сыров и окрасить по Граму в соответствии с методикой (см. лабораторную работу № 2). Зарисовать микроскопическую картину. Определить вид микроорганизмов в составе исследуемых заквасок, используя приемы сравнения с наглядными материалами (рис. 15). Сделать выводы о соответствии вида заквасочных культур составу заквасок.
Рис. 15. Клетки некоторых видов молочнокислых бактерий, бульонная культура (96 ч): 1 - L. acidophilus; 2 - L. fermentum; 3 - L. plantarum; 4 - L. casei; 5 - L.buchneri; 6 - L. brevis; Х 1680
Контрольные вопросы
1. Назовите основные группы молочнокислых микроорганизмов и примеры их применения в биотехнологическом производстве.
2. Назовите основные свойства молочнокислых микроорганизмов.
3. Какими биотехнологическими характеристиками обладают молочнокислые микроорганизмы?
4. Каковы основные методы идентификации молочнокислых бактерий?
Оформление отчета
Отчет должен содержать:
1. Цель работы.
2. Описание состава основных заквасок.
3. Наблюдаемую микроскопическую картину исследуемых препаратов заквасочных микроорганизмов.
4. Выводы.