ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ - Е.П. СУЧКОВА - 2016
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5
ИЗУЧЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ХЛЕБОПЕКАРНЫХ И ПИВНЫХ ДРОЖЖЕЙ
Цель работы - изучить биотехнологические характеристики дрожжей и их применение в пищевой биотехнологии на примере хлебопекарных и пивных дрожжей.
Ход работы. Выполняются задания:
Задание 1. Ознакомиться с составом и свойствами хлебопекарных и пивных дрожжей.
Задание 2. Изучить технологический процесс приготовления засевной дозы дрожжей.
Задание 3. Приготовить препараты дрожжей и исследовать их морфологический состав.
Задание 4. Исследовать свойства пивных и прессованных хлебопекарных дрожжей.
Выполнение лабораторной работы предусматривает опережающую теоретическую подготовку и использование учебно-методической литературы на занятии.
Теоретическое обоснование
Дрожжи являются одноклеточными неподвижными микроорганизмами, широко распространенными в природе; они встречаются в почве, на листьях, стеблях и плодах растений, в разнообразных пищевых субстратах растительного и животного происхождения. Они относятся к одному большому подразделению растительного царства Mycophyta. Микофиты отличаются от водорослей и высших растений тем, что они не содержат хлорофилла и, следовательно, не способны создавать для себя пищу путем фотосинтеза.
Дрожжи, используемые в хлебопечении и в бродильных производствах, относятся к семейству сахаромицетов, роду Saccharomyces. Формы клеток дрожжей разнообразны: шаровидная, полушаровидная, овальная, удлиненно-овальная, цилиндрическая, лимоновидная (апикулярная), стрельчатая, вытянутая. Размеры дрожжевых клеток варьируют в широких пределах: мелкие клетки имеют диаметр 1,5-2,0 мкм, длину 3-5 мкм; диаметр крупных клеток 8-10 мкм, длина 11-18 мкм; вытянутые клетки достигают в длину 20-25 мкм. Величина дрожжевых клеток зависит от расы, физиологического состояния дрожжей и состава питательной среды. Прессованные дрожжи содержат около 30 % сухих веществ и 70 % воды. В сухих веществах дрожжей содержится 90-95 % органических веществ и 5-10 % неорганических веществ. Среди органических веществ имеются белки и азотсодержащие вещества - 54-56 %, углеводы - 24-40 %, жиры - 2-4 % (к массе сухих веществ). Основная часть углеводов представлена гликогеном (запасное вещество), сходным по химическому строению с амилопектином крахмала. Среди неорганических веществ около половины фосфорной кислоты и 1/3 калия. Фосфорные соединения имеют важное значение в обмене веществ дрожжевых клеток, так как входят в состав промежуточных веществ спиртового брожения, а калий играет первостепенную роль в построении молекул белков и углеводов. Дрожжи богаты витаминами группы В, содержат эргостерин (провитамин D) и др. В дрожжах содержатся различные ферментные системы, участвующие в процессах гидролиза и синтеза, а также в процессах брожения и дыхания.
Температурный оптимум для размножения дрожжей находится в пределах 25-30 °С. Низкие температуры дрожжи переносят хорошо, хотя размножение их приостанавливается (минимальная температура развития дрожжей 2-3 °С). При температуре 40 °С рост и развитие дрожжей прекращается, дрожжи отмирают.
Дрожжи чувствительны к высокой концентрации растворенных в среде веществ. При высокой концентрации сахара в среде жизнедеятельность дрожжей прекращается, так как при этом увеличивается осмотическое давление среды и наступает плазмолиз клеток. Величина предельной концентрации сахара для различных рас дрожжей неодинакова.
Культурные дрожжи относятся к ацидофилам, т. е. развиваются в кислой среде, оптимальное значение рН для дрожжей 4,5-5,0. Являются факультативными анаэробами. Дрожжи могут получать свою энергию в присутствии кислорода (аэробно) путем дыхания и в отсутствие кислорода (анаэробно) путем брожения. Широкое использование дрожжей в промышленности основано на их способности вызывать спиртовое брожение.
Использование микроорганизмов в хлебопечении
Изготовление хлеба представляет собой цикл сложных биохимических процессов, происходящих в тесте с момента смешивания муки с водой и заканчивая его выпечкой. В состав муки, используемой для выпечки пшеничного и ржаного хлеба, входят компоненты, необходимые для развития многих микроорганизмов. Кроме крахмала в муке содержится до 2 % сбраживаемых сахаров - глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, раффинозы. Мука хороших сортов пшеницы содержит до 14 % белка, до 2 % жиров и жироподобных веществ и до 2 % минеральных веществ, в том числе микроэлементы. Решающую роль в приготовлении хлеба наряду с ферментами муки играет жизнедеятельность микроорганизмов. Наиболее важное значение имеют дрожжи и молочнокислые бактерии, для развития которых в тесте есть все необходимые условия: влажность 40-50 %, незначительное содержание молекулярного кислорода и наличие питательных веществ.
Ведущая роль в формировании качества хлеба принадлежит дрожжам. Микробиологические процессы и связанные с ними биохимические изменения в тесте определяют пористость, окраску и сохранение свежести хлеба, придают ему вкус и аромат, несколько повышают его пищевую ценность.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae (рис. 16) различных рас являются главными разрыхлителями теста. Для хлебопечения особенно важны такие свойства дрожжей, как высокая потенциальная активность гликолитических ферментов, стойкость их хранения, способность переносить высокие концентрации сахаров и NaCl в среде. В хлебопечении чаще всего используют быстрорастущие расы сахаромицетов верхового брожения. У полноценных рас дрожжей подъемная сила, т. е. длительность подъема теста на стандартную высоту 70 мм в стандартной форме, должна быть не более 45 мин. На хлебозаводах применяют прессованные и сухие дрожжи.
Рис. 16. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae
Схема приготовления жидких дрожжей из прессованных и сухих включает в зависимости от сорта хлеба заквашивание осахаренной и охлажденной до 50 °С мучной заварки молочнокислыми бактериями, например, Lactobacillus delbrueckii. Они ускоряют процесс брожения в тесте и обладают высокой протеолитической активностью, которая позволяет накапливать в тесте значительное количество аминного азота, положительно влияющего на скорость роста и подъемную силу дрожжей. Наряду с сахаромицетами в тесто могут спонтанно попадать дрожжи родов Candida и Pichia - C. krusei, C. utilis, C. guilliermondii, P. xylosa, P. vini. В пшеничных и ржаных заквасках преобладают молочнокислые бактерии, а не дрожжи. По микробиологическому составу закваски ржаные и пшеничные различаются. Молочнокислые бактерии в зависимости от влажности и температуры - в заквасках пшеничных и ржаных преобладают: в густых - L. plantarum, L. brevis, L. paracasei; в жидких - L. fermentum, L. casei, L. plantarum. Дрожжи: пшеничные закваски - преимущественно S. cerevisiae;ржаные - преимущественно C. milleri и незначительно - S. cerevisiae, при использовании заварок - преимущественно S. cerevisiae.
Использование микроорганизмов в пивоварении
Отличительная особенность пивных дрожжей - функциональная способность питаться жидкими гидратными растворами сахаров (трисахарида раффинозы) и к выработке в процессе брожения спиртов и двуокиси углерода. Дрожжевая клетка на 75 % состоит из воды. В сухом веществе дрожжей содержатся 90 % органики: белков - 40-60 %; углеводов - 25-35 % и липиды. Минеральная составляющая клетки - калий, фосфор, кальций и др.
Метаболизм дрожжей в пивном сусле оказывает тонкое влияние на вкусовые качества и характерный аромат пива, поэтому подбор культурных рас дрожжей является привилегией и очень сложной проблемой любого пивовара.
Среди чистых культур пивоваренных дрожжей имеется много штаммов или рас. Эти дрожжи встречаются лишь в условиях низового брожения, в других субстратах их нет. Штаммы пивоваренных дрожжей различаются физиологическими признаками.
В отечественной промышленности применяют в основном пивоваренные дрожжи низового брожения Сахаромицес Карлсбергензис. Эти дрожжи имеют общие свойства: овальную или эллиптическую форму, размеры (длина 8-10 мкм, ширина 4-6 мкм); являются факультативными анаэробами; споры образуют редко; размножаются почкованием; по Граму окрашиваются положительно (рис. 17).
Рис. 17. Форма клеток пивоваренных дрожжей
Уровень жизнедеятельности дрожжей зависит от различных условий:
- углеводного состава сусла. Определяется наличием в сусле сбраживаемых и несбраживаемых сахаров. Содержание сбраживаемых сахаров в сусле составляет 70-80 % сухих веществ. Это мальтоза (60-70 %), мальтотриоза (15-20 %), глюкоза (10-15 %).
Быстрее всего сбраживаются моносахара, медленнее мальтоза и хуже всего мальтотриоза;
- азотистого состава сусла. Азотистые вещества необходимы клеткам для синтеза компонентов, обеспечивающих их рост и размножение. Наиболее ценными и важными источниками азота являются аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания. От биосинтеза и распада аминокислот зависит образование ароматических веществ. Образуемые при биосинтезе дрожжей аминокислоты придают пиву бархатистую консистенцию. При неблагоприятных условиях культивирования они могут быть причиной дрожжевого привкуса и помутнения пива;
- температуры и наличия в среде кислорода. При низкой температуре и анаэробных условиях размножение дрожжей замедляется, но вырастают они более крупными с большим запасом резервных веществ и высокой бродильной активностью. При повышении температуры и аэрации увеличивается потребность дрожжей в питательных веществах, размеры клеток уменьшаются, они не содержат запасных веществ и вырастают более слабыми.
Сахара сусла при производстве пива сбраживаются дрожжами в спирт. Среди дрожжей вида Saccharomyces serevisiae, применяемых преимущественно в пивоварении в качестве культурных дрожжей, различают многочисленные штаммы. В пивоваренной практике эти штаммы делят на две большие группы - дрожжи верхового и низового брожения. Между ними существуют морфологические, физиологические и технологические различия (рис. 18).
Рис. 18. Пивные дрожжи низового (а) и верхового (б) брожения под микроскопом
Морфологические признаки. Дрожжи верхового и низового брожения можно отличить под микроскопом по картине их почкования. Дрожжи низового брожения представляют собой почти исключительно отдельные клетки или их пары, тогда как дрожжи верхового брожения образуют почечные сообщества. У дрожжей верхового брожения материнская и дочерняя клетки, как правило, долго между собой связаны, благодаря чему образуются разветвленные сообщества клеток. У дрожжей низового брожения материнские и дочерние клетки после размножения отделяются друг от друга. Форма же клеток у тех и других дрожжей одинакова.
Физиологические различия. Важнейший физиологический отличительный признак дрожжей верхового и низового брожения состоит в сбраживании трисахарида раффинозы. Дрожжи низового брожения со своим набором ферментов могут полностью перерабатывать раффинозу, тогда как дрожжи верхового брожения сбраживают трисахарид лишь на 1/3. Другие отличительные признаки касаются обмена веществ при дыхании и брожении, а также способности к спорообразованию. В то время как дрожжи низового брожения в основном используют обмен веществ путем брожения, дрожжи верхового брожения отличаются выраженным обменом веществ путем дыхания. В соответствии с этим после брожения прирост биомассы у верховых дрожжей больше, чем низовых. Дрожжи низового брожения беднее ферментами, чем верховые. У них ограничена способность образовывать аскоспоры, по сравнению с верховыми они образуют споры реже и спорообразование продолжается дольше.
Технологические различия при сбраживании. Название штаммов дрожжей верхового или низового брожения происходит от характерной картины их поведения при брожении.
Дрожжи верхового брожения в процессе брожения в основном поднимаются на поверхность, тогда как низового брожения по окончании опускаются на дно. Дрожжи верхового брожения также опускаются на дно по окончании брожения, но значительно позже низовых. К моменту сбора дрожжей в конце главного брожения они еще находятся наверху и продолжают размножаться (если используются открытые чаны).
Другим существенным признаком дрожжей низового брожения является особенность хлопьеобразования, по этому признаку пивные дрожжи низового брожения разделяют на пылевидные и хлопьевидные. У пылевидных дрожжей клетки тонко распределены в бродящем сусле и медленно опускаются на дно лишь в конце брожения. Клетки хлопьевидных дрожжей через некоторое время собираются в большие хлопья и затем быстро оседают. Способность дрожжей образовывать хлопья обусловлена генетически и передается по наследству. Дрожжи верхового брожения хлопья не образуют. Способность штаммов дрожжей образовывать хлопья имеет большое практическое значение. Хлопьевидные дрожжи дают пиво лучше осветленное, но с более низкой степенью сбраживания, чем пылевидные и дрожжи верхового брожения, тогда как верховые пылевидные дрожжи дают не такое прозрачное пиво, но с повышенной степенью сбраживания. Дрожжи верхового и низового брожения различаются также по применяемым температурам брожения. Низовыми дрожжами сбраживают сусло при температурах от 4 до 12 °С, а с верховыми штаммами дрожжей работают при температурах от 14 до 25 °С. Температуры брожения устанавливает пивовар.
К виду дрожжей Saccharomyces cerevisiae относятся не только культурные штаммы, но также дикие дрожжи, опасные для пивоварения. Например, для пива вредителями являются винные дрожжи, а также дрожжи некоторых других видов и родов (рис. 19).
Рис. 19. Винные дрожжи Saccharomyces chevalieri
Попадание таких микроорганизмов в пиво называется контаминацией (инфицированием). Эти микроорганизмы, называемые, в отличие от культурных дрожжей, дикими дрожжами, попадают в пивоваренное производство главным образом с сырьем и всегда нежелательны. Они могут вызывать в пиве неприятные вкус и запах, а также помутнение.
Методические указания
Оборудование и материалы: микроскоп, предметные стекла, иммерсионное масло, бактериологические петли, фильтровальная бумага, покровные стекла, спиртовки, растворы основных красок: фуксин Пфейффера, краска Грама, раствор Люголя, раствор метиленовой сини, вода дистиллированная, спирт 96 %, весы лабораторные аналитические, водяная баня, термостат, влагомер «Эликс», пипетки на 5 и 10 см3, мерный цилиндр на 100 см3, колбы на 50-100 см3, бюретки на 25 см3, стаканы на 50 см3, чашка фарфоровая, пестик, шпатель, термометр со шкалой 0-100 С, 1 %-й раствор фенолфталеина, 0,1 н. раствор гидроксида натрия, 2,5 %-й водный раствор NaСl, мука пшеничная 2-го сорта с базисной влажностью 14,5 %, пакеты из газетной бумаги.
Подготовить препараты дрожжей.
Исследовать свойства пивных и прессованных хлебопекарных дрожжей. Определить влажность и кислотность дрожжей. Сделать вывод о соответствии полученных показателей требованиям ГОСТ Р 54731-2011.
Определить подъёмную силу прессованных хлебопекарных дрожжей. Подготовить и исследовать образцы теста, приготовленные на водном растворе поваренной соли, воде, молочной сыворотке и обезжиренном молоке.
Сравнить полученные результаты и сделать выводы.
Техника определения
Дрожжи разводят в стерильной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле были одиночные клетки микроорганизмов. Для исследования взять каплю суспензии дрожжей.
Приготовить препараты «раздавленная капля», окрашенные препараты - простым методом с применением метиленовой сини и по методу Грама в соответствии с методикой (см. лабораторную работу № 2).
Рассмотреть препарат «раздавленная капля» в микроскоп. Сначала рассмотреть на малом увеличении; найти участок, где клетки лежат не густо, и перевести на большое увеличение. На основе наблюдений найдите разные штаммы дрожжей, отличающиеся видом клеток. В пекарских дрожжах обычно присутствуют две расы: одна представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании; другая - удлинённо-цилиндрическими, образующими при почковании кустики. Рассмотреть окрашенные препараты. Зарисовать микроскопическую картину.
Определение содержания влаги в пищевых системах с помощью влагомера «Эликс» (прибор Чижовой)
Определение влажности на этом приборе основано на прогревании испытуемого материала инфракрасными (тепловыми) лучами, излучаемыми темным нагретым телом. Скорость высушивания в приборе обеспечивается быстрым прогревом до относительно высоких температур при кратковременной выдержке исследуемого продукта, распределенного тонким слоем в бумажном пакете. Прибор состоит из двух металлических плит круглой или четырехугольной формы с электрическим обогревом, скрепленных шарнирами, имеющих приспособление для регулирования зазора между плитами. Применяют слабый и сильный обогрев: при слабом (100 Вт для каждой пластины) нагревание до 160 °С достигается за 100-110 мин, при сильном (400-500 Вт для каждой пластины) - за 20-25 мин. С сильного обогрева на слабый переключают с помощью переключателя. В каждую плиту прибора вмонтированы термометры для измерения температуры греющих поверхностей. При рабочем состоянии прибора расхождение в температуре верхней и нижней пластин не должно превышать 5 °С.
Расстояние между нагревательными поверхностями прибора не должно превышать 2 мм, что регулируется специальным приспособлением. При закладке и выемке пакетиков с исследуемым продуктом верхний блок прибора не следует поднимать выше, чем под углом 45°. Нагревательные поверхности прибора должны быть всегда чистыми.
Для определения влаги в продукте применяют пакеты (одно- или двухслойные) из слабо проклеенной бумаги типа газетной. При работе на приборе круглой формы для изготовления пакетов берут бумагу размером 150x150 мм, складывают по диагонали, загибают углы и затем края примерно на 15 мм. При работе на приборе прямоугольной формы берут листы бумаги размером 200x140 мм, складывают пополам и загибают края примерно на 15 мм (рис. 20).
Рис. 20. Схема приготовления бумажных пакетов
Техника определения
При определении влажности прессованных дрожжей пакет из газетной бумаги вкладывают в листок пергамента несколько большего размера, чем первый пакет, не загибая краев. Готовые пакеты высушивают в приборе в течение 3 мин при температуре, при которой должен высушиваться исследуемый продукт, после чего их охлаждают и хранят в эксикаторе. Одновременно можно высушивать до шести пакетов.
Подготовленный пакет взвешивают с точностью до 0,01 г и помещают в него 4-5 г исследуемого продукта, который по возможности распределяют равномерно по всей внутренней поверхности пакета, быстро взвешивают. Вес пустого пакета и с навеской удобно записать на бортике пакета. Пакет с навеской закрывают, помещают в прибор, включенный на слабый нагрев и нагретый до требуемой температуры, после чего выдерживают при этой температуре необходимое время. Температура 150-152 °С и продолжительность выдержки 2 мин.
Одновременно можно высушивать 2 пакета. При высушивании продуктов с относительно высокой влажностью, таких как дрожжи, в связи с интенсивным выделением паров в первые моменты сушки пакет вздувается, поэтому верхнюю плиту прибора в начале сушки, во избежание разрыва пакета, приподнимают и поддерживают в таком положении до прекращения обильного выделения паров, которое обычно длится 30-50 с. Затем плиту опускают и продолжают высушивание в течение времени, установленного для данного продукта. Пакеты с высушенными пробами охлаждают в эксикаторе 3-5 мин и взвешивают.
Содержание влаги в продукте Х в процентах определяют по формуле
где m0 - масса пакета, г; m1 - масса пакета с навеской до высушивания, г; m2 - масса пакета с навеской после высушивания, г. Результат записать.
Определение кислотности прессованных дрожжей
Повышение кислотности, прежде всего, свидетельствует о зараженности дрожжей кислотообразующими бактериями. Кислотность выражают в миллиграммах уксусной кислоты на 100 г дрожжей.
Техника определения
Навеску дрожжей (10 г) перенести в фарфоровую ступку и растереть в 50 мл дистиллированной воды комнатной температуры.
Прибавить 3 капли фенолфталеина и оттитровать 0,1 н. раствором NaОH (перемешивая содержимое пестиком) до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение 1 мин.
Обработать результаты.
Кислотность дрожжей в пересчете на уксусную кислоту (Н) в миллиграммах на 100 г дрожжей вычисляют по формуле
где V - объем 0,1 моль/дм3 раствора щелочи, израсходованный на титрование, см3; 6 - объем уксусной кислоты, соответствующий 1 см3 0,1 н. раствора NaОН, мг; 100 - переводной коэффициент; К - поправочный коэффициент 0,1 моль/дм3 раствора NaОН. Вычисления проводят с точностью до целого числа.
Ускоренный метод определения подъемной силы дрожжей (по шарику)
Метод основан на определении скорости всплывания в воде шарика теста, замешанного в строго определенных условиях. Быстротой подъема теста читают количество минут, прошедших со времени опускания шарика теста в воду до момента его всплывания. Всплывание происходит тем скорее, чем быстрее увеличивается объем в результате накопления углекислого газа дрожжами. Плотность свежезамешанного теста около 1,4 г/см3. В процессе брожения она уменьшается; когда плотность шарика станет меньше единицы, он всплывает. Хорошие дрожжи поднимают шарик за 14-20 мин. Если подъем шарика происходит после 24 мин, дрожжи считаются неудовлетворительного качества.
Техника определения
От средней пробы отбирают и на лабораторных весах взвешивают 0,31 г дрожжей; переносят в фарфоровую чашку и приливают 4,8 см3 приготовленного раствора поваренной соли, нагретого до 35 °С; тщательно перемешивают шпателем или пестиком.
К полученному раствору добавляют 7 г муки, замешивают тесто и придают ему форму шарика.
Шарик опускают в стакан с водой, нагретой до температуры 35 °С, и помещают в термостат с той же температурой.
Обрабатывают результаты.
Подъемная сила дрожжей характеризуется временем, прошедшим с момента опускания шарика в воду до момента его всплывания.
Время подъема шарика в минутах умножают на коэффициент 3,5, полученный эмпирически, для определения подъемной силы.
Повторяют эксперимент в соответствии с методикой и определяют подъёмную силу дрожжей, используя для замешивания теста вместо раствора поваренной соли дистиллированную воду, молочную сыворотку и обезжиренное молоко.
Сравнивают результаты исследования и делают выводы.
Контрольные вопросы
1. Опишите свойства дрожжей, важные для хлебопечения.
2. Каковы условия среды, благоприятные для развития дрожжей?
3. Назовите морфологические признаки дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
4. Охарактеризуйте благоприятные условия жизнедеятельности пивных дрожжей.
5. Каковы морфологические особенности дрожжей верхового и низового брожения?
6. Назовите технологические различия при сбраживании среды дрожжами верхового и низового брожения.
7. Каким методом определяется подъемная силы дрожжей? Что характеризует этот показатель?
8. Почему дрожжевым организмам отводится важная роль в пищевой промышленности?
9. Почему молочная сыворотка часто используется в качестве питательной среды?
Оформление отчета
Отчет должен содержать:
1. Цель работы.
2. Описание основных характеристик хлебопекарных и пивных дрожжей
3. Наблюдаемую микроскопическую картину исследуемых дрожжей.
4. Результаты исследования свойств дрожжей.
5. Выводы.