БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Вектори

Вектори — молекули ДНК, що використовуються для перенесення генів від організму-донора до організму-реципієнта, а також для клонування нуклеотидних послідовностей.

Ідеальна векторна молекула повинна володіти такими властивостями:

- тривалий час існувати в популяції клітин-реципіентів;

- мати біохімічні або генетичні маркери, що дозволили б виявити наявність вектора у клітинах;

- структура векторної молекули повинна допускати вбудовування в неї чужорідної послідовності нуклеотидів без порушення її функціональної цілісності.

Як вектори використовують плазміди, косміди, хромосоми вірусів, штучні хромосоми бактерій, бактеріофагів, дріжджів, ссавців (табл. 1.1).

Таблиця 1.1

Порівняльна характеристика різних векторів для клонування ДНК

Плазмідні вектори найчастіше використовуються в генній інженерії. Плазміди - це позахромосомні дволанцюгові кільцеві молекули ДНК, що автономно реплікуються. У клітині плазміди працюють як ген, здійснюючи синтез нових білків.

Першу плазміду відкрили Дж.Дж. Келлі, Г.О. Сміт та К. Уілкокс у 1968 р. Американський біохімік Стенлі Коен висловив припущення про те, що плазміди можна використовувати для перенесення генів. Проведено експерименти з ллазмідами різних видів бактерій. Учені створили рекомбінантні плазміди з фрагментів плазмід золотистого стафілокока Staphylococcus aureus (стійкість до пеніциліну) і кишкової палички Е.соlі (стійкість до тетрацикліну). Гібридні плазміди ввели в клітини Е.соlі, отриманий штам був стійким до пеніциліну і тетрацікліну. Цей експеримент довів, що можна здійснювати перенесення генетичної інформації між різними видами організмів.

Плазміди є практично у всіх бактерій. Головна хромосома бактерій містить 1000-5000 генів. Плазміди містять менш ніж 5% генетичної інформації (50 250 генів). Одні з них містять гени, що забезпечують їх перенесення з однієї клітини в іншу (F-плазміди), інші містять гени стійкості до антибіотиків (R-плазміди) або гени, що забезпечують утилізацію ксенобіотиків (плазміди деградації). Розмір плазмід може бути менше 1 і більше 500 тис. п. н.

Деякі плазміди представлені в клітинах 10-100 копіями, які називаються висококопійними. Низькокопійні плазміди містяться у клітинах у кількості І - 4 копії. Частка плазмідної ДНК становить 0,1-5% від загального вмісту ДНК у клітині.

Плазміди серії pBR використовуються як основа для конструювання плазмідних векторів. Ці плазміди створені на основі природної плазміди, що дає клітинам Е.соlі стійкість до коліцину. Недоліком плазмідних векторів є їх мала ємність.

Вектори на основі хромосоми бактеріофага λ використовують, якщо необхідно вбудувати великий фрагмент ДНК. Молекула ДНК бактеріофага λ має довжину близько 45 тис. п. н., усередині молекули розміщується ділянка довжиною 15 тис. и. н., яку можна замінити на будь-який фрагмент ДНК. У вектори на основі хромосоми бактеріофага λ можна вбудовувати фрагменти ДНК довжиною 15-25 тис. п. н.

Вірусні вектори застосовуються в експериментальній генній терапії під час лікування людей. Недоліком векторів на основі хромосоми бактеріофага λ є те, що генетичний матеріал вбудовується в будь-які ділянки молекули ДНК, процес перенесення генів важко контролювати.

Косміди - це невеликі плазміди, в які in vitro введені cos-сайти ДНК бактеріофага λ. Cos-сайти розміщуються на відстані 35—45 тис. п. н, один від одного, між cos-сайтами міститься весь геном фага, він може бути замінений на аналогічний за довжиною фрагмент чужорідної ДНК. Косміди можуть включати до 40 тис. п. н. чужорідної ДНК і при цьому активно ампліфжуватися в клітинах Е.соlі.

Фазміди — це векторні молекули ДНК, що містять генетичні елементи плазмід і хромосом бактеріофагів.

Штучні хромосоми - це дволанцюгові молекули ДНК з теломсрами на кінцях, центромерою і сайтами зв’язування для ДНК-полімерази. З метою введення великих фрагментів ДНК у диференційовані та ембріональні клітини створено штучні хромосоми бактерій (ВАС - bacterial artificial chromosome), бактеріофагів (РАС - PI phage-derived artificial chromosome), дріжджів (YAC - yeast artificial chromosome), ссавців (MAC - mammalian artificial chromosome) і людини (НАС-human artificial chromosome).

Найчастіше застосовують бактеріальні штучні хромосоми, створені у 1992 р. Основою їх є F-плазміда Е.соlі, бактеріальні теломери та центромєра. Ці структури дозволяють уводити в клітину великий фрагмент ДНК довжиною до 300 тис. п. н. Бактеріальні штучні хромосоми достатньо стабільні в бактеріальному геномі, під час росту і розмноження бактерій штучні хромосоми рєплікуються.

Над створенням перших штучних хромосом на основі дріжджів працювали А. Мюрей і Дж. Шостак (1983) та Д. Берк (1987). Такі штучні хромосоми можуть включати ще більший обсяг генетичного матеріалу — фрагмент ДНК довжиною до 1 млн п. н. Недоліком їх є менша стабільність порівняно з бактеріальними штучними хромосомами.

Штучні хромосоми тварин і людини дають змогу вводити в них цілі генетичні локуси й одержувати експресію відповідних генів у культурі клітин чи трансгенних тваринах. Перші штучні хромосоми людини створено у 1997 р. Штучні хромосоми не вбудовуються в геном клітини. Усередині клітини вони функціонують як автономні мініхромосоми, здійснюючи експресію генів. Штучні хромосоми вводять у клітини шляхом електропорації. Під дією електричних імпульсів у клітинній мембрані утворюються пори, через які штучні хромосоми проникають усередину клітини.