БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Вектори для трансформації рослинних клітин

Залежно від способу доставки трансгенів у клітини рослин розрізняють два типи векторних систем:

1) пряме введення трансгена в клітини або протопласти, позбавлені клітинної стінки (електропорація, бомбардування, Са²⁺-залежна трансформація у присутності етиленгліколю);

2) вектори на основі Ті-плазмід грунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens, що здійснює трансформацію рослинних клітин у природних умовах.

Agrobacterium tumefaciens - це фітопатоген, що спричиняє утворення пухлини (корончатого гала), яка порушує нормальний ріст рослини (рис. 1.3). Ця бактерія вражає дводольні рослини, зокрема виноград, фруктові дерева, троянди. Бактерію Agrobacterium називають природним генним інженером через її здатність переносити в клітини рослин частину власних генів. Вірулентні штами агробактерій містять Ті-плазміди, розмір яких становить 200-250 тис. п. н. ДНК у складі Ті-плазмід називають Т-ДНК (transferred DNA), вона інтегрується в геном рослинної клітини.

Під час ураження рослини в ній починає синтезуватися специфічна речовина (ацетосирингон), що активує гени вірулентності (vir-гени), локалізовані в Ті-плазмідах агробактерій. Продукти vir-генів необхідні для транспорту й інтеграції Т-ДНК у геном рослинної клітини.

Рис. 1.3. Ураження рослин Agrobacterium tumefaciens

Т-ДНК містить гени, більшість яких активується тільки після вбудовування у геном рослини. Ці гени кодують ферменти синтезу фітогормонів — ауксинів і цитокінінів, що спричиняють збільшення розмірів рослинних клітин та їх проліферацію. Надлишок фітогормонів зумовлює появу пухлини. Крім генів фітогормонів, Т-ДНК містить гени, що кодують опіни. Опіни — це продукти конденсації аміно- і кетокислот. Наприклад, під час конденсації аргініну і ПВК утворюється октопін, аргініна і α-кетоглутарата - нопалін.

Опіни є джерелом Карбону і Нітрогену для агробактерій. Таким чином, у процесі еволюції сформувався механізм трансформації рослинної клітини в «біологічну фабрику», що виробляє опіни для потреб бактерій Agrobacterium tumefaciens.

На основі Ті-плазмід Agrobacterium tumefaciens створено вектори для трансформації рослинних клітин. Для введення генів у рослини використовують ділянку Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens. Із Т-ДНК видаляють гени фітогормонів і гени метаболізму опінів і вбудовують у неї ген, який необхідно транспортувати в ядро клітини-реципієнта.

За допомогою Ті-плазмід Agrobacterium tumefaciencs в Інституті фізіології і біохімії рослин Сибірського відділення РАН була виведена трансгенна осика. Дерева з уведеними генами ugt і acb у 5 -10 разів швидше ростуть, ніж звичайні.

Крім Ті-плазмід, для доставки генів у клітини рослин використовують метод бомбардування мікрочастинками, на поверхні яких адсорбована ДНК. Золоті або вольфрамові частинки діаметром 0,4 - 1,2 мкм зі швидкістю 300 - 600 м/с пробивають клітинну стінку і мембрани рослинних клітин, транспортуючи ДНК в ядро. Метод бомбардування дозволяє трансформувати однодольні і хвойні рослини, для яких неможливо застосовувати Ті-плазміди Agrobacterium tumefaciens.

Більш безпечними для довкілля є рослини, в яких трансгени містяться у хлоропластах, оскільки при цьому зменшується ризик поширення трансгенів серед близьких видів. Розроблено методи вбудовування генів у хлоропласту або мітохондріальну ДНК, необхідний білок синтезується у цих оргаонелах.

У хлоропластах рослин міститься 1 — 10% від сумарної кількості ДНК. Для генома хлоропластів (пластома) характерний високий рівень поліплоїдії (10³ —10⁵ копій на клітину). Окрема клітина із трансформованими хлоропластами містить тисячі копій трансгена, що дозволяє одержати високий рівень експресії рекомбінантних білків (до 25% від сумарної кількості білка). Вектори для трансформації хлоропластів є кільцевими молекулами ДНК. Вони дозволяють уводити у пластом фрагменти ДНК довжиною більше 50 тис. п. н. (20 - ЗО генів). Уведення векторів У хлоропласти здійснюють бомбардуванням або трансформацією у присутності поліетиленгліколю.

Порівняльна характеристика різних методів трансформації рослинних клітин наведена у табл. 1.3.

Таблиця 1.3

Методи введення ДНК у клітини рослин