БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Трансгенні рослини

Рослини, стійкі до комах-шкідників

Для створення таких рослин використовують експресію генів токсинів у самих рослинах. Трансгенні рослини стійкі до шкідників переважно за рахунок інсектицидних токсинів, що походять із бактерій Bacillus thuringiensis. Одна із форм гена протоксина була введена в такі рослини: томати, тютюн, картоплю, рис, кукурудзу, баклажан, яблуню, люцерну, горіх, тополю, ялину, бавовник, журавлину. Трансгенні рослини томатів і картоплі етапи стійкими до колорадського жука, а рослини бавовнику - до бавовникової совки. Але жоден із типів протокисна Bacillus thuringiensis не може бути ефективним відносно всіх видів комах.

Також ефективним механізмом захисту рослин від комах-шкідників є введення генів рослинних білків — інгібіторів амілаз і протеїназ. Уведення гена інгібітора α-амілази захищає трансгенні рослини (зернові, бобові) від зерновки Callosobruchus maculates і довгоносика C.chincnsis. Уведення гена інгібітора II лротеїнази в рослини рису захищає їх від рожевого стеблового точильника Sesamia inferens — основного шкідника рису. Одночасне використання токсину Bacillus thuringiensis та інгібітора серинової протеїнази підвищує ефективність захисту рослин від шкідників.

Альтернативний метод виведення рослин, стійких до комах- шкідників, полягає у використанні бактеріального гена холестеролоксидази. Цей фермент синтезується різними бактеріями, він каталізує окиснення 3-гідроксистероїдів з утворенням кетостероїдів і Н₂О₂. Ген холестеролоксидази був виділений із штаму Streptomyces і введений у протопласти клітин тютюну. Установлено, що фермент проявляє інсектицидну активність проти личинок довгоносика бавовнику Anthonomus grandis grandis. Перспективним є використання цього гена для захисту від комах-шкідників рослин бавовнику.

Застосування генної інженерії дозволить скоротити використання хімічних інсектицидів на 40 — 60%.

Рослини, стійкі до вірусів

Віруси суттєво знижують урожайність рослин. Природний імунітет до вірусних інфекцій обумовлений різними причинами: блокуванням проникнення вірусу в рослини, попередженням його поширення, пригніченням симптомів вірусної інфекції. Трансгенні рослини повинні бути стійкими більш, ніж до одного вірусу.

Селекціонери намагалися перенести природні гени стійкості до вірусів від однієї лінії рослин до іншої. У геном рослин уводили вірусні гени, що кодують білки оболонки вірусів. Якщо рослина містить ген білка вірусної оболонки, то здатність вірусу проникати в рослину і поширюватися в ній значно знижується. За допомогою цього підходу одержують трансгенні рослини з високим рівнем стійкості до вірусів, Виявлено, що ген білка оболонки одного вірусу може забезпечувати стійкість до інших вірусів. Найефективнішою стратегією захисту рослин від вірусів є введення в рослини кількох генів, що детермінують синтез білків вірусної оболонки.

Рослини, стійкі до фітопатогенних грибів і бактерій

Як правило, у відповідь на проникнення грибів чи бактерій рослини синтезують групу специфічних PR-білків (pathogenesis-related proteins): β-1,3-глюканаза, хітиназа, інгібітори протеїназ, що діють на патогени. Одержані трансгенні рослини рису і тютюну, що синтезують у значній кількості хітиназу - фермент, що гідролізуе р-1,4-з’вязки в молекулі М-ацетил-D-глюкозаміна - основного компонента клітинної стінки грибів.

Підраховано, що збитки в результаті ураження картоплі патогенною ґрунтовою бактерією Erwinia carotovora становлять близько 100 млн доларів за рік. Були виведені трансгенні рослини картоплі, що містять ген лізоциму бактеріофага Т4. Ці рослини виявилися стійкими до Erwinia carotovora. Оскільки лізоцим руйнує різні види бактерії (грам+ і грам-), цей підхід може використовуватися для захисту рослин від багатьох бактеріальних патогенів.

Рослини, стійкі до гербіцидів

На виробництво більше 100 хімічних гербіцидів у світі щороку витрачається понад 10 млрд доларів, проте втрати врожаю через велику кількість бур’янів перевищують 10%. Деякі гербіциди мають однакову дію як на бур’яни, так і на сільськогосподарські культури. Гербіциди можуть накопичуватися в навколишньому середовищі.

У процесі створення стійких до гербіцидів трансгенних рослин необхідно:

- забезпечити інактивацію гербіциду в рослині під час метаболізму;

- зменшити здатність білка-мішені зв’язуватися із гербіцидом;

- забезпечити синтез білка-мішені у надлишковій кількості.

Деякі приклади генетично обумовленої стійкості рослин до дії гербіцидів наведені у табл. 1.4.

Таблиця 1.4.

Генетично обумовлена стійкість рослин до дії гербіцидів

Рослини, стійкі до сольового стресу В умовах посухи і засолення ґрунтів рослини синтезують низькомолекулярні речовини - осмопротектори, що сприяють поглинанню і затримці води, запобігають руйнуванню макромолекул у клітинах рослин за дії високих концентрацій солей. Осмопротекторами є вуглеводи, спирти, солі амонію, пролін, бетаїн. Бетаїн відіграє основну роль під час захисту рослин від сольового стресу. Бетаїн синтезується із холіну. Деякі сільськогосподарські культури (картопля, рис, томати) не здатні накопичувати бетаїн. Уведення в рослини гена бетаїну Е.соІі підвищує їх стійкість до високих концентрацій солей (300 мМ) на 80%.

Рослини з подовженими термінами дозрівання плодів

Передчасне дозрівання - це основна проблема під час транспортування плодів. У процесі дозрівання плодів у рослинах активуються специфічні гени, що кодують ферменти целюлазу і полігалактуроназу. Якщо блокувати експресію цих генів, дозрівання затримається.

Регулятор росту рослин етилен ініціює експресію багатьох генів, що відповідають за дозрівання плодів. Етилен синтезується із S-аденозилметіоніна. Обробка рослин хімічними препаратами, що блокують синтез етилену, затримує дозрівання плодів. Створено трансгенні рослини, в яких плоди мали тривалий термін зберігання за рахунок пригнічення синтезу етилену.

Німецькі вчені з Кельнського інституту рослинництва створили помідор з генами американської плоскої риби (камбали), що відповідають за терморегуляцію. Цей помідор можна зберігати за температури 12°С у нестиглому вигляді протягом кількох місяців (у теплі дозріває за кілька годин).

Зміна забарвлення квітів

Зміна забарвлення квітів відіграє надзвичайно важливу роль у галузі квітникарства. Понад 70% від обсягу індустрії квітникарства становлять троянди, гвоздики, тюльпани, хризантеми. За допомогою методів генної інженерії створюються нові сорти квітів із незвичайним забарвленням. Це досягається завдяки маніпуляціям із генами ферментів біосинтезу пігментів антоціанів. Вихідною речовиною для синтезу антоціанів є фенілаланін.

У перспективі за рахунок маніпуляцій із генами білків, що визначають запах, можливе створення рослин з будь-яким ароматом.

Зміна харчової цінності рослин

Завдяки методам генної інженерії стало можливим підвищення харчової цінності рослин за рахунок зміни складу білків та ліпідів. Були створені сорти рису і кукурудзи з підвищеним вмістом білків та амінокислот. Особливо цінними є сорти рослин, що містять значну кількість незамінних амінокислот. Створено трансгенні сорти сої, в яких вміст незамінної амінокислоти лізину у 5 разів вищий, ніж у звичайних рослин.

75% від загальної кількості масляних культур становлять соя, пальма, рапс, соняшник. Створено трансгенні сорти рапсу, що синтезують ліпіди зі зміненим жирнокислотним складом. Особливо цінними є жири з високим вмістом поліненасичених вищих жирних кислот, оскільки вони не синтезуються в організмі людини.

Синтез вітаміну А в «золотому» рисі — продукт спільних наукових розробок дослідницьких груп Інго Потрикуса (Швейцарія) і Пітера Бейера (Німеччина). Рис містить 2 гени нарциса і ї ген бактерій, зернівки мають золотисто-жовтий колір.

За допомогою генної інженерії можна покращувати смак плодів рослин. З плодів африканської рослини Dioscorephyllum cumminsii Diels був виділений білок монеллін, що у 100 000 разів солодший за сахарозу. Монеллін — це дволанцюговий димер. А-ланцюг містить 45 амінокислотних залишків, В-ланцюг - 50. Для створення трансгенних рослин, здатних синтезувати монеллін, необхідно клону вати обидва гени. Для розв’язання цієї проблеми ген, що кодує А- і В-ланцюги, був синтезований хімічним шляхом. Створено трансгенні томати і салат, які синтезують монеллін. Синтетичний ген монелліна вводили в рослини за допомогою Ті-плазмід Agrobacterium tumefaciens.

Рослини як біореактори

Використання рослин для синтезу корисних речовин має низку переваг порівняно з використанням мікроорганізмів:

1) у рослин процесинг і фолдинг білків відбувається аналогічно до тварин;

2) трансформація рослин має стабільний характер, чужорідна ДНК вбудовується в рослинний геном;

3) вирощування рослин не потребує великих витрат і не лімітується можливостями процесів ферментації;

4) продукти синтезу трансгенних рослин безпечні у застосуванні (немає, ризику забруднення препарату білка вірусами чи пріонами);

5) можна створити умови, за яких чужорідні білки будуть синтезуватися у насінні, де їх цілісність не порушується тривалий час.

В ідеалі рослина - це продуцент біопрепарату, вона має бути неїстівною і не здатною виживати у природних екосистемах, якщо її насіння рознесеться вітром або тваринами. Трансгенні рослини повинні вирощуватися в регіонах, де відсутні їх близькоспоріднені види.

Створено експериментальні установки для одержання за участі рослин ферментів, моноклональних антитіл, функціональних фрагментів антитіл, а також полімерів.

Відомо, що бактерії Alcaligenes eutrophus синтезують полімер полі-р-гідроксибутират. Особливістю цього полімеру є його здатність до біодеградації. В бактеріях пол і-β~ гідро ксибутират синтезується з ацетил-КоА за участі трьох ферментів. Гени цих ферментів були вбудовані в ДНК хлоропластів рослини Arabidopsis thaliana у складі векторів на основі Тінтлазмід. У листках трансгенних рослин, ідо місять усі три бактеріальні гени, синтезується більш ніж 1 мг полі-р-гідроксибутирату на 1 г сирої тканини листка.

Створено технології виробництва фармацевтичних і діагностичних препаратів за участі рослин. За допомогою трансгенних рослин кукурудзи одержують моноклональні антитіла проти респіраторно-синцитіального вірусу, ревматоїдного артриту і лімфоми. Створено трансгенні банани, що містять інактивовані форми вірусу холери, гепатиту В, діареї. У Московському інституті картоплярства виведена картопля, що синтезує людський інтерферон крові.

Хлоропласти рослин краще здійснюють синтез людських білків, ніж мікроорганізми чи рослини з генами, вбудованими в їхні ядра. Тютюн найбільш придатний для продукування білків людини. Тривають розробки технології одержання людського соматотропіну у хлоропластах тютюну.

Важливим завданням біотехнології є попередження забруднення харчових і кормових рослин біопрепаратами, а також мінімізація їх впливу на навколишнє середовище.