БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Виділення генів

Для розуміння молекулярних механізмів функціонування окремих генів і взаємопов’язаних генетичних систем велике значення має робота з ізольованими генами. Такі дослідження дозволяють установлювати розміри генів, виділяти їх у чистому вигляді, ідентифікувати елемента структури, важливі для функціонування.

Першим етапом у виділенні генів є розрізання рестриктазами ДНК на невеликі фрагменти. Рестриктази розщеплюють полінуклеотидний ланцюг у специфічних ділянках - сайтах рестрикції. Як правило, сайти рестрикції є паліндромними послідовностями, в яких спостерігається подвійна симетрія (у напрямку 5'→3' послідовності нуклеотидів ідентичні). Відомо понад 200 унікальних послідовностей ДНК, що розпізнаються специфічними рестриктазами. Ферменти рестрикції здійснюють непрямий розріз через обидва ланцюги ДНК, а ступінчатий, у результаті чого утворюються «липкі» кінці, які можуть легко з’єднуватися один з одним.

Наприклад,

Якщо змішати два фрагменти ДНК з ідентичними «липкими» кінцями, то вони з’єднаються. Лінійні «липкі» кінці з’єднуються водневими зв’язками. Для ковалентного з’єднання розривів використовують фермент ДНК-лігазу бактеріофага Т₄ (каталізує утворення 3',5'-фосфодиефірного зв’язку).

За допомогою ферментів рестрикції хромосомну ДНК і ДНК плазміди вдається перевести в лінійну форму, а згодом їх фрагменти з’єднати.