Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов
Сбор клеток

Чтобы очистить продукт ферментации, нужно прежде всего отделить клетки от культуральной среды. Сбор генетически модифицированных и исходных, нетрансформированных клеток можно проводить одними и теми же методами. Однако трансформированные клетки часто обладают другими физиологическими свойствами (они имеют другой размер или синтезируют внеклеточные полисахариды), и в результате условия, оптимальные для сбора нетрансформированных клеток, могут не подходить для клеток, синтезирующих чужеродный белок.

Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды часто используют высокоскоростное центрифугирование. Для этого сконструированы специальные высокоскоростные центрифуги полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан работающей центрифуги, клетки концентрируются в нем, а осветленная среда удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавливают и клетки собирают. Основное неудобство данного способа — необходимость останавливать процесс, а затем снова начинать его. Кроме того, недостатками являются высокая стоимость оборудования и потребляемой им энергии, вероятность утечки микроорганизмов в окружающую среду, невозможность полного удаления клеток из среды.

Таблица 16.1. Синтез рекомбинантного белка, одним из компонентов которого является пептид инсулина В, при периодической ферментации и при периодической ферментации с добавлением субстрата^1,2)

¹⁾ По данным работы Gosset et аl, Appl. Microbiol. Biotedmol. 39: 541—546, 1993.

²⁾ Количество биомассы измеряется в граммах сухого вещества на литр культуры. Процедура «Периодическая ферментация + Тrр» означает, что к культуре добавлено 0,1 г триптофана. При периодической ферментации с добавлением субстрата в среду добавляли 0,1 г триптофана каждые 2 ч — в общей сложности пять раз в течение 10 ч. При добавлении большего количества триптофана не увеличивались ни биомасса, ни количество синтезированного белка.

Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды — фильтрация через мембрану. К сожалению, при обычной фильтрации клетки со временем забивают поры мембранного фильтра, накапливаются на его поверхности, и в результате скорость процесса быстро снижается (рис. 16.7, А). Фильтрацию можно ускорить, проводя ее под давлением, но это лишь временный эффект; клетки все равно будут накапливаться на поверхности мембраны, а кроме того, под давлением они образуют более плотный и менее проницаемый слой.

Рис. 16.7. Способы фильтрации, применяющиеся для сбора клеток. А. Фильтрация с необратимым забиванием фильтра. Б. Фильтрация с параллельным потоком клеточной суспензии. Стрелки — направление потока.

Чтобы решить эту проблему, клеточную суспензию пропускают с высокой скоростью параллельно поверхности мембраны (рис. 16.7, Б), так что через мембрану за один раунд проходит только небольшая часть циркулирующей жидкости. Остальная ее часть очищает мембрану от накопившихся клеток (см. рисунок), и в результате скорость фильтрации падает не так быстро, как при необратимом забивании фильтра. После многочисленных раундов фильтрации через мембрану проходит почти вся культуральная среда. Этот метод используется пока только в лаборатории; в промышленных процессах для сбора клеток применяют центрифугирование.

Дальнейшие действия зависят от природы и локализации продукта. Если продукт представляет собой белок, находящийся в культуральной среде, то среду концентрируют, а белок очищают хромотографическими или другими методами. Если продукт — это низкомолекулярное соединение, находящееся в культуральной среде, то используют соответствующие методы экстракции. Hаконец, если продукт имеет внутриклеточную локализацию, то прежде чем очищать его, клетки разрушают.