Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011
Клонирование ДНК
Плазмидные векторы Е. coli
Плазмиды - это двухнитевые молекулы ДНК, которые присутствуют в клетке отдельно от хромосомной ДНК. Эти экстрахромосомальные ДНК, которые обнаружены в бактериях и низших клетках эукариот (например, в дрожжах), являются паразитами или симбиотами клетки.
Плазмиды, подобно хромосомной ДНК, реплицируются перед каждым делением клетки. В ходе клеточного деления копии плазмид распределяются между дочерними клетками, обеспечивая размножение плазмид в последующих поколениях клеток.
В технологии рекомбинантных ДНК обычно используют те плазмиды, которые размножаются в Е. coli. Исследователи конструируют эти плазмиды таким образом, чтобы оптимизировать их использование в качестве векторов для клонирования ДНК.
Например, если удалить "лишние" участки из "естественных" плазмид Е. coli. то получится плазмидный вектор длиной «1,2-3 kb, содержащий три необходимых для клонирования элемента (рисунок 86):
1) ориджин репликации,
2) маркерный участок, который обеспечивает селекцию вектора (обычно это ген резистивности к определённому лекарственному препарату),
3) участок, в который может быть встроена экзогенная ДНК - фрагмент ДНК, подлежащий репликации.
Рисунок 86 - Основные компоненты плазмидного клонирующего вектора
На рисунке 86 представлена схема плазмидного вектора, содержащего ген аmрr, который обеспечивает возможность отбора (селективность) данной плазмиды, поскольку он кодирует фермент ß-лактамазу, а этот фермент обеспечивает резистентность (r, сопротивляемость) к антибиотику ампициллину.
Экзогенная ДНК может быть вставлена в отмеченный на рисунке участок без ущерба для способности плазмиды реплицироваться или экспрессировать ген аmрr.
Включение в состав плазмиды искусственно синтезированного полилинкера, содержащего сайты рестрикции для нескольких различных рестрикционных ферментов, расширяет диапазон применимости данного вектора.
Полилинкером называется искусственно синтезированная последовательность нуклеотидов, содержащая по одной копии нескольких разных сайтов рестрикции, которых нет больше нигде в теле плазмиды.
Ферменты клетки начинают репликацию плазмиды с ориджина репликации (ORI) - специфической последовательности ДНК длиной 50-100 пар оснований. Начавшись на ориджине, репликация продолжается вдоль всей круговой ДНК, независимо от того, являются ли последовательности нуклеотидов "исходными" последовательностями плазмиды, или они были "встроены" искусственно.
Таким образом, любая вставленная в плазмиду последовательность ДНК будет реплицирована вместе с остальной частью плазмиды.
На рисунке 87 представлена схема клонирования фрагмента ДНК с использованием плазмидного вектора Е. coli.
Когда клетки Е. coli смешивают с рекомбинантными векторными ДНК, при определённых условиях может происходить процесс трансформации - захват некоторыми клетками плазмидных векторов. Обычно одна клетка из 10 000 (0,01%) поглощает одну плазмидную молекулу ДНК и становится, тем самым, трансформированной.
Трансформированные клетки могут быть селектированы от нетрансформированных. Если, например, плазмида содержит ген, обеспечивающий сопротивляемость антибиотику ампициллину, то только трансформированные клетки могут выжить в среде, содержащей ампициллин. Эти клетки далее размножаются, образуя ампициллин-резистентную колонию.
Рисунок 87 - Клонирование ДНК плазмидным вектором
Фрагменты ДНК размером от нескольких пар оснований до ~ 20 kb обычно помещают в плазмидные векторы. Если предпринять специальные меры предосторожности, чтобы механически не разрушить ДНК, то в плазмидный вектор можно вставить и более длинные фрагменты ДНК.
Когда рекомбинантная плазмида с вставленным фрагментом трансформирует клетку Е. coli, все дочерние клетки будут содержать копии этой плазмиды и будут резистентны (устойчивы) по отношению к антибиотику.
Внедренный фрагмент ДНК реплицируется вместе с плазмидой и переходит от поколения к поколению клеток по мере роста колонии клеток. Таким способом изначальный фрагмент ДНК реплицируется в колонии клеток в большое число идентичных копий.
Поскольку клетки колонии произошли от единственной трансформированной родительской клетки, то они формируют клон клеток, а исходный фрагмент ДНК, вставленный в родительскую клетку называют клонируемой ДНК или клоном ДНК.
Плазмидный вектор Е. coli можно сделать более универсальным, если внедрить в него полилинкер (рисунок 86). Когда такой вектор обрабатывается рестрикционным ферментом, который распознает сайт рестрикции в полилинкере, вектор разрезается только однократно и только в этом сайте.
После этого любой фрагмент ДНК (подходящего размера), полученный тем же самым рестрикционным ферментом, может быть вставлен в разрезанную плазмиду с помощью ДНК-лигазы.
Плазмиды, содержащие полилинкер позволяют исследователям клонировать фрагменты ДНК, полученные с помощью разных рестрикционных ферментов, используя один и тот же плазмидный вектор, что, безусловно, упрощает проведение экспериментов.
Реальные плазмиды, которые используются в технологии рекомбинантных ДНК намного сложнее той схематичной плазмиды, которая показана на рисунке 86.
Для примера на рисунке 88 представлена схема плазмидного вектора pBR322, который часто используют в биотехнологии с клеткой Escherichia coli.
На рисунке показана схема плазмиды, содержащей 4361 пару оснований ДНК. Плазмида содержит ориджин репликации (orz) и два гена, которые кодируют белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, один к ампициллину (ampR), другой к тетрациклину (tetR). По периметру плазмиды указаны местоположение сайтов рестрикции, на которые действуют различные рестрикционные ферменты, и обозначение соответствующего рестрикционного фермента.