Общая микробиология - Шлегель Г. 1987

Регуляция метаболизма
Регуляция путем изменения каталитической активности ферментов

Ранее мы рассмотрели возможности, которыми располагает клетка для приспособления внутриклеточной концентрации ферментов к нуждам метаболизма. Путем синтеза новых ферментов или разбавления уже имеющихся (в результате роста) клетки могут лишь медленно адаптироваться к измененным условиям среды. Более быстрое приспособление клетки к резко меняющейся метаболической ситуации достигается путем изменения каталитической активности ферментов.

16.2.1 Механизмы регуляции

Скорость ферментативной реакции, т. е. количество субстрата, превращаемое в единицу времени (как правило, в микромолях субстрата, превращенного за 1 мин), зависит как от концентраций фермента (Е) и субстрата (S) или продукта (Р), так и от сродства фермента к субстрату (Кm), а также от максимальной скорости реакции (v_max). К_m - это так называемая константа Михаэлиса - Ментен; она равна той концентрации субстрата, при которой активность фермента составляет половину максимальной (v_mах/2). Максимальная скорость реакции достигается при избытке субстрата, т. е. тогда, когда фермент насыщен субстратом. К_m и v_mах - кинетические параметры фермента.

Простые ферменты. Для большинства ферментов характерна гиперболическая кривая насыщения субстратом. Скорость реакции зависит только от концентраций субстрата и продукта и гиперболически возрастает с повышением концентрации субстрата, т. е. удовлетворяет условиям соотношения Михаэлиса-Ментен. Такие ферменты называют простыми или «гиперболическими» ферментами (рис. 16.9, А, черная кривая).

Понятно, что при высокой концентрации субстрата фермент перерабатывает его быстрее, чем при более низкой концентрации. Насколько чувствительно реагирует фермент на изменение концентрации субстрата, зависит от крутизны кривой его насыщения субстратом. Чем круче кривая, тем больше повышается скорость реакции при незначительном сдвиге концентрации субстрата. Как видно из рис. 16.9, А, крутизна кривой и соответственно чувствительность больше всего при низких концентрациях субстрата. Из этих рассуждений ясно, что скорость оборота веществ в клетке зависит от их концентрации. Как правило, субстраты ферментов (метаболиты) содержатся в клетке в концентрациях ниже К_m.

Рис. 16.9. Кривые насыщения субстратом для «гиперболических» и «сигмоидных» ферментов. А. Кривые насыщения субстратом «гиперболического» фермента (черная) и «сигмоидного» фермента (красная). Б. Эффекторы изменяют ход кривой - положительные эффекты (+) в сторону повышения сродства фермента к субстрату, а отрицательные (-) в сторону его понижения. Серым и красным цветом показаны области наибольшей чувствительности.

Регуляторные ферменты. Свойства регуляторных ферментов намного более сложны. Кривые насыщения субстратом для большинства этих ферментов отклоняются от гиперболической формы и часто становятся сигмоидными (рис. 16.9, А и Б). У таких кривых имеется область значительно большей крутизны, чем у кривых насыщения для простых ферментов. В этой области, примерно между ¹/₂ и 1 ¹/₄ К_m, регуляторные ферменты очень чувствительны - даже небольшого изменения концентрации субстрата достаточно, чтобы сильно изменить скорость реакции.

Сигмоидная форма кривой указывает на то, что фермент построен из субъединиц, между которыми существуют кооперативные взаимодействия. Очевидно, связывание субстрата с каталитическим центром одной из субъединиц фермента повышает сродство к субстрату других участков связывания в той же молекуле. Регуляторные ферменты состоят из двух или более, чаще всего из четырех, субъединиц.

Кроме каталитических центров, распознающих и связывающих субстраты, у регуляторных ферментов есть и другие стереоспецифические участки - так называемые аллостерические центры. Это места связывания эффекторов, изменяющих сродство фермента к субстрату. Имеются особые участки для связывания положительных эффекторов (активаторов) и для отрицательных эффекторов (ингибиторов). Под влиянием эффекторов изменяется форма кривой насыщения (степень ее «сигмоидности» (рис. 16.9, Б). Говорят не только об аллостерических центрах, но также об аллостерическом торможении и аллостерических ферментах (термины «аллостерические ферменты», «регуляторные ферменты» и «сигмоидные ферменты» часто употребляют как синонимы).

Рис. 16.10. «Симметричная» и «последовательная» модели аллостерических ферментов. На схеме представлен фермент, состоящий из четырех идентичных субъединиц.

Степень кооперативности выражают с помощью коэффициента кооперативности (или коэффициента Хилла) n. Он соответствует числу зависимых друг от друга областей связывания или числу субъединиц, участвующих в кооперативной реакции. При отсутствии кооперативности n = 1. Для аллостерического фермента, состоящего из четырех субъединиц, возможны значения n > 1 и n < 4 в зависимости от степени положительной кооперативности. При отрицательной кооперативности n < 1. Кроме того, имеются более сложные системы, на которых мы здесь останавливаться не будем.

Модели кооперативности. Попытки объяснить кооперативность между субъединицами ферментов, проявляющуюся в сигмоидной форме кривой насыщения субстратом, сводятся к двум гипотезам: «симметричной» модели (Моно и сотр.) и «последовательной» модели (Кошленд); они схематически представлены на рис. 16.10.

В основу обеих моделей положено представление о том, что ферменты могут существовать в различных формах - в активной форме (с высоким сродством к субстрату) и в неактивной (с малым сродством к субстрату). В каком соотношении между собой будут находиться разные формы фермента, зависит от наличия и концентрации лигандов (молекул субстрата, активаторов и ингибиторов). Разница между гипотезами касается того, как происходит конформационное изменение.

Согласно симметричной модели, фермент представлен только двумя конформационными состояниями, находящимися в динамическом равновесии. При этом все субъединицы данной молекулы фермента находятся в одной и той же конформации; промежуточных состояний нет, существуют только симметричные олигомеры (рис. 16.11). Равновесие характеризуется аллостерической постоянной L. В отсутствие лигандов, как правило, неактивное основное состояние Т (от англ. tense -напряженный) преобладает над активным состоянием R (от англ. relaxed - расслабленный). При добавлении лигандов они реагируют с теми молекулами фермента, которые находятся в соответствующей конформации: ингибиторы - с молекулами в состоянии Т, субстраты и активаторы - с молекулами в состоянии R. При связывании субстрата фермент удерживается в состоянии R. Чтобы восстановить равновесие между двумя конформационными состояниями, часть других молекул фермента тоже переходит в состояние R. Поскольку каждая молекула имеет несколько участков для связывания субстрата, небольшого числа молекул субстрата достаточно для того, чтобы привести намного большее число таких участков в состояние высокой каталитической активности; таким образом, облегчается связывание и других молекул субстрата. В этом и состоит кооперативный эффект, определяющий сигмоидную форму кривой «концентрация субстрата - скорость реакции». Отрицательный эффектор оказывает обратное действие.

Рис. 16.11. Схема, дающая представление о характере равновесия между состоянием с малой каталитической активностью и состоянием с высокой активностью аллостерического фермента, состоящего из четырех субъединиц (согласно «симметричной» модели). Пояснения в тексте. (Kirschner К., Ergebn. Microbiol., 44 [1968], 123.)

В последовательной модели предполагается, что фермент приобретает каталитически активную конформацию только в результате взаимодействия с субстратом (рис. 16.10). Если фермент состоит из нескольких субъединиц, то конформационное изменение одной из них, вызванное субстратом, последовательно передается другим субъединицам и облегчает им связывание добавочных молекул субстрата. Возможно образование несимметричных олигомеров (на рис. 16.10 это тетрамеры) с субъединицами, имеющими разную конформацию. Присутствие активаторов способствует переходу в активную форму, а отрицательные эффекторы его затрудняют.

Аллостерические ферменты и эффекторы. Регуляторные ферменты, как правило, имеются в каждом пути биосинтеза и в некоторых путях катаболизма. В большинстве случаев они находятся в начале цепи биосинтеза и занимают, таким образом, ключевую позицию.

Аллостерические эффекторы представляют собой низкомолекулярные соединения - это либо конечные продукты биосинтеза, либо вещества, концентрация которых может отражать состояние клеточного метаболизма, например ATP, ADP, АМР, ацетил-СоА, фосфоенолпируват и NADH₂.

Рис. 16.12. Регуляция глутаминсинтетазы Escherichia coli путем химической модификации при участии специального фермента. Знаком «плюс» указан положительный эффектор (стимуляция), знаком «минус» - отрицательный эффектор (торможение). (Holzer Н., Duntze W., Ann. Rev. Biochem. 40 [1971], 345.)

Изменение активности ферментов путем ковалентной модификации.

Для небольшого числа ферментов известен регуляторный механизм иного типа: они могут изменяться под действием других ферментов. Это изменение может приводить к повышению или снижению активности фермента. Оно может состоять в аденилировании, фосфорилировании или ацетилировании. Речь идет об относительно быстром процессе. У млекопитающих под воздействием ферментов активируются и инактивируются гликогенфосфорилаза и гликогенсинтетаза. У Escherichia coli не только подавляется образование глутаминсинтетазы, но и активность имеющегося фермента за несколько минут снижается на 80-90%, если в питательную среду добавить ионы аммония. Это снижение активности обусловлено катализируемой особым ферментом химической модификацией: активная глутамин синтетаза а в результате ее аденилирования превращается в неактивную глутаминсинтетазу b (рис. 16.12). Наличие глутамина в клетке стимулирует аденилирующий фермент, а свободный 2-оксоглутарат оказывает противоположное действие. После удаления из среды ионов аммония в клетках создается недостаток глутамина, и глутаминсинтетаза вновь реактивируется в результате отщепления групп адениловой кислоты (АМР) под действием деаденилирующей системы.

16.2.2 Специфические механизмы регуляции

Пути биосинтеза. Как. правило, путем ингибирования конечным продуктом регулируется первый фермент данной биосинтетической последовательности реакций. Если в клетке происходит избыточное образование и накопление конечного продукта, то в результате торможения первого фермента деятельность всей цепи тотчас же замедляется. В процессе

биосинтеза изолейцина из треонина таким ферментом служит треониндезаминаза:

Регулируемые и нерегулируемые изофункциональные ферменты (изозимы). Следует отметить, что не всякая треониндезаминаза ингибируется изолейцином. Если Escherichia coli растет в аэробных условиях на среде с глюкозой и солями аммония, то ее клетки содержат только одну треониндезаминазу, на анаболическую функцию которой указывает аллостерическое торможение изолейцином. Но если клетки растут в анаэробных условиях на среде со смесью аминокислот (пептон и гидролизат казеина), то происходит репрессия синтеза анаболической треониндезаминазы и образуется изозим, обладающий катаболической активностью и подверженный аллостерическому регулированию только со стороны АМР и ADP.

Другим примером может служить образование 2-ацетиллактата в клетках Enterobacter aerogenes. Эта реакция, катализируемая синтазой ацетогидроксикислот, с одной стороны, участвует в анаэробном сбраживании глюкозы с образованием ацетоина (катаболизм); с другой стороны, с нее начинается путь синтеза валина (анаболизм). Таким образом, 2-ацетиллактат является общим промежуточным продуктом разветвленной цепи реакций:

Клетки могут синтезировать два изофункциональных фермента. Один из них образуется только в том случае, если во время брожения снизилось значение pH и конечным продуктом является нейтральный ацетоин. Другой фермент тоже синтезируется в нейтральной и слабощелочной среде; он имеет высокий оптимум pH и подвержен аллостерическому подавлению валином.

Как видно из этих примеров, взаимовлияние двух путей обмена может исключаться в результате образования изозимов, активность одного из которых обычно строго регулируется, тогда как другой не подвергается регуляции того же типа.

Разветвленные пути биосинтеза. Особые проблемы возникают в тех случаях, когда на первый этап биосинтеза действуют два или большее число конечных продуктов. Если в какой-то гипотетической последовательности реакций А превращается в Е, G и Н, то первый этап, А → В, будет подавляться и в случае накопления лишь одного конечного продукта (например, Н). Однако это вызовет также снижение синтеза двух других продуктов - G и Е. Подобные проблемы, возникающие при регуляции разветвленных путей биосинтеза, разные организмы, видимо, разрешили по-разному. До сих пор было найдено несколько различных типов регуляции для ферментов, функционирующих на расходящихся или параллельных путях метаболизма.

1. Первый этап катализируется несколькими изозимами, каждый из которых регулируется особым конечным продуктом.

2. Первый этап катализируется одним ферментом, при этом возможны разные варианты: а) для ингибирования общего первого этапа все конечные продукты должны присутствовать в избытке; или б) каждый из конечных продуктов действует независимо от остальных (кумулятивное ингибирование), причем общее торможение может превышать сумму отдельных эффектов (кооперативное ингибирование).

Первый этап биосинтеза аминокислот метионина, лизина, треонина и изолейцина («семейство аспарагиновой кислоты») катализируют несколько изозимов (рис. 16.13). У Escherichia coli в реакции

Аспартат + АТР → Аспартил-4-фосфат + ADP

участвуют три параллельно действующие аспартаткиназы, активность которых регулируется разными конечными продуктами. Аспартаткиназу I и гомосериндегидрогеназу I ингибирует треонин. Аспартаткиназа III регулируется лизином. Аспартаткиназа II не подвержена аллостерической регуляции. В регуляции аспартаткиназ участвуют еще дополнительные механизмы, причем в каждом случае первый фермент, специфичный для данного пути биосинтеза, ингибируется конечным продуктом этого пути.

Подобного рода схема регуляции существует и для «семейства ароматических аминокислот» (см. рис. 7.17). Первый этап биосинтеза фенилаланина, тирозина, триптофана и 4-аминобензойной кислоты состоит в реакции эритрозо-4-фосфата с фосфоенолпируватом, в результате которой образуется 3-дезокси-D-арабиногептулозо-6-фосфат (ДАГФ). У Е. coli имеются три ДАГФ-синтазы. Одна из них контролируется тирозином, вторая - фенилаланином, а третий, малоактивный фермент не ингибируется. Дополнительная регуляция и в этом случае осуществляется по принципу ретроингибирования (отрицательной обратной связи).

Фосфофруктокиназа и эффект Пастера. Эффект Пастера - торможение гликолиза дыханием - можно объяснить тем, что между системами фосфорилирования в дыхательной цепи и на уровне субстрата существует конкуренция за ADP и фосфат (разд. 8.1). Согласно новейшим данным, расщепление гексоз по фруктозобисфосфатному пути контролируется в первую очередь путем аллостерической регуляции активности фосфофруктокиназы (рис. 16.14). Фосфофруктокиназу из пекарских дрожжей аллостерически ингибирует АТР. В присутствии АТР увеличивается сигмоидность кривой насыщения фермента субстратом. Очень важно то, что, хотя 5'-трифосфаты инозина, гуанозина и цитозина и могут служить вместо АТР донорами фосфатных групп, они не выполняют ни ингибирующей, ни регулирующей функции. Это означает, что аллостерический центр фермента обладает высокой специфичностью в отношении АТР и что его сигнал однозначен. Напротив, специфичность каталитического центра незначительна. АМР действует как положительный эффектор и снимает торможение, вызываемое АТР. Другие моно- и дифосфаты не действуют совсем или действуют очень слабо. У Escherichia coli роль положительного эффектора играет не АМР, a ADP. Фосфофруктокиназа ингибируется также цитратом; при этом АТР усиливает этот эффект, а фруктозо-6-фосфат ослабляет его.

Рис. 16.13. Регуляция биосинтеза аминокислот семейства аспарагиновой кислоты у Escherichia coli. Красными линиями показаны воздействия конечных продуктов, ингибирующие ферментативную реакцию (И) или/и репрессирующие синтез данного фермента (Р).

Рис. 16.14. Схема, иллюстрирующая некоторые взаимодействия между ферментами и метаболитами, за счет которых осуществляется регуляция распада гексоз и синтеза запасных веществ. В схеме использованы данные, полученные для дрожжей, животных тканей и бактерий. Метаболиты, выполняющие важные эффекторные функции, выделены красным цветом. Отходящие от них тонкие черные стрелки означают положительные воздействия, а красные стрелки - отрицательные воздействия. Фр-6-Р-фруктозобисфосфат; Фр-6-P-фруктозо-6-фосфат; Фр-6-Раза-фруктозобисфосфатаза; Гл-6-Р-глюкозо-6-фосфат; ГА-Р-глицеральдегид-3-фосфат; ФЕП - фосфоенолпируват.

Знание аллостерических свойств фосфофруктокиназы позволяет сделать следующий вывод: если аэробно растущие дрожжевые клетки или клетки тканевой культуры лишить кислорода и приостановить таким образом окислительное фосфорилирование, то в клетке снизится соотношение концентраций АТР/АМР, что приведет к повышению активности фермента и соответственно к ускорению реакции. То, что регуляция процессов в живой клетке действительно происходит описанным путем, удалось подтвердить, измеряя внутриклеточные концентрации глюкозы, глюкозо-6-фосфата, фруктозо-6-фосфата, фруктозо-1,6-бисфосфата и триозофосфатов до и после перехода от анаэробных условий к аэробным. Непосредственно после аэрирования культуры концентрация глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата возрастает, а содержание фруктозобисфосфата и триозофосфатов резко снижается. Таким образом, фосфофруктокиназа действует как клапан, регулируемый аденилатами и другими метаболитами; когда он закрыт, метаболиты, находящиеся «выше» него в цепи, накапливаются, а расположенные «ниже» продолжают участвовать в реакциях, и их количества уменьшаются. Это позволяет понять, почему при переходе к аэробным условиям потребление глюкозы падает.

Глюконеогенез. Аденилаты ATP, ADP, АМР и СоА-производные жирных кислот оказывают регулирующее воздействие на многие реакции, участвующие в катаболизме гексоз, в промежуточном обмене и в синтезе запасных веществ. Регуляция фосфофруктокиназы служит, по-видимому, тем главным клапаном, с помощью которого регулируется поток субстрата, направляемый по фруктозобисфосфатному пути. Соответствующий фермент, контролирующий у некоторых бактерий расщепление субстрата по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатному пути, - это, очевидно, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Ее тоже в сильной степени ингибируют АТР и NADH₂.

Образование глюкозы из пирувата или лактата (глюконеогенез) играет определенную роль тогда, когда эти и другие вещества служат источниками углерода в отсутствие углеводов. Синтез идет по фруктозобисфосфатному пути, за исключением трех необратимых реакций (рис. 16.14). Эти этапы катализируются регулируемыми ферментами. В животных тканях путь от пирувата к фосфоенолпирувату проходит через оксалоацетат. Первая реакция катализируется пируваткарбоксилазой и зависит от присутствия ацетил-СоА. По-видимому, ацетил-СоА играет в данном случае роль сигнала, свидетельствующего о насыщении всех реакций, использующих это соединение, в особенности реакций конечного окисления через цикл трикарбоновых кислот. Такая регуляция гарантирует получение энергии и допускает синтез глюкозы лишь при избытке ацетил-СоА. Кроме того, зависимость образования оксалоацетата от ацетил-СоА может быть существенной для обеспечения цикла трикарбоновых кислот необходимым количеством оксалоацетата.

При глюконеогенезе реакция с участием фруктозобисфосфатазы

Фруктозо-1,6-бисфосфат + Н₂O → Фруктозо-6-фосфат + Р_i

дает возможность обойти вторую необратимую реакцию цепи гликолиза. Фруктозобисфосфатазу ингибирует АМР, который служит здесь индикатором степени насыщения клетки высокоэнергетическими соединениями. Избыток АМР означает, что поступление АТР недостаточно для насыщения реакций, связанных с затратой энергии. Кажется вероятным, что в таких условиях глюконеогенез тормозится для усиления распада глюкозы и увеличения выхода энергии.

Цикл трикарбоновых кислот. У дрожжей АТР сильно понижает сродство цитратсинтазы к ацетил-СоА. У Е. coli и других бактерий высокая концентрация NADH₂ сигнализирует о насыщении дыхательной системы и о том, что потребление субстрата в цикле трикарбоновых кислот должно быть снижено. Ингибитором 2-оксоглутаратдегидрогеназы, цитратсинтазы и пируватдегидрогеназы служит NADH₂(рис. 16.14). Синтез запасных жиров. Запасные вещества накапливаются, как правило, в тех случаях, когда источники углерода и энергии имеются в избытке, но рост клеток невозможен из-за недостатка соединений азота или серы. Сигнал к образованию жиров (жирных кислот) и полисахаридов исходит главным образом от промежуточных продуктов. У дрожжей реакцией, лимитирующей скорость синтеза жирных кислот, является карбоксилирование ацетил-СоА при участии ацетил-СоА-карбоксилазы:

Этот фермент занимает первое место на пути биосинтеза жирных кислот с длинной цепью. Другие процессы синтеза, в которых исходным соединением служит ацетил-СоА (синтез каротиноидов, стероидов, цитрата, малата и др.), не нуждаются в активирующем воздействии малонил-СоА. Ацетил-СоА-карбоксилаза активируется цитратом. Повышение содержания цитрата, способствуя образованию малонил-СоА, тем самым стимулирует синтез жирных кислот с длинной цепью и нейтральных жиров (триглицеридов). Роль отрицательных эффекторов играют при этом СоА-производные пальмитиновой и других жирных кислот. При накоплении СоА-производных происходит ингибирование конечным продуктом.

Синтез запасных полисахаридов. Исходным соединением для синтеза запасных полисахаридов (гликогена и крахмала) служит глюкозо-1-фосфат. Он активируется нуклеозидтрифосфатом (NuTP), после чего глюкозильная группа переносится на полиглюкозную цепь:

В то время как синтез гликогена в печени происходит с участием UDP-глюкозы, для синтеза крахмала у зеленых растений и гликогена у различных бактерий используется ADP-глюкоза. Гликогенсинтетаза печени активируется глюкозо-6-фосфатом. Регуляторные системы, имеющиеся у бактерий и растений, сильно отличаются от системы, действующей в клетках печени. Регуляция осуществляется через пирофосфорилазу. У Escherichia coli, Arthrobacter и Rhodospirillum rubrum, а также в листьях шпината АМР и ADP действуют как ингибиторы, а предшественники (глюкозо-1-фосфат) - как стимуляторы. Пирофосфорилаза Е. coli активируется фруктозобисфосфатом, глицеральдегидфосфатом и фосфоенолпируватом; фермент R. rubrum активируется пируватом, а фермент из листьев шпината - 3-фосфоглицератом, фосфоенолпируватом и фруктозобисфосфатом. Синтез полисахаридов - прекрасный пример того, как один и тот же результат может достигаться с помощью разных регуляторных систем.

Автотрофная фиксация двуокиси углерода. Фиксация СO₂ в рибулозо-1,5-бисфосфатном цикле - один из метаболических процессов, требующих наибольших затрат энергии. Отсюда понятно, что существуют регуляторные механизмы, обусловливающие высокую скорость этого цикла лишь в том случае, если обеспечен достаточный приток энергии для поддержания структуры и функций клетки (для синтеза мономеров и полимеров, обновления ферментов и др.). Фосфорибулокиназа подвержена специфической регуляции: АМР (реже ADP) ингибирует этот фермент, a NADH₂ активирует его.

Энергетический заряд клетки. Приведенные примеры подтверждают предположения о том, что аденилаты выполняют в клетке важные регуляторные функции и что они в известной степени представляют собой общие для катаболизма и анаболизма сигналы, обеспечивающие нужное соотношение между получением энергии и процессами биосинтеза. Внутриклеточное содержание ATP, ADP и АМР (или, точнее, соотношение между этими тремя аденилатами) определяет скорость отдельных реакций, а тем самым и сложных процессов распада и синтеза.

Было принято количественное выражение для «энергетического заряда» (ЭЗ) клетки:

Коэффициент 0,5 представляет собой произвольную величину, введенную для удобства (чтобы параметр мог варьировать в пределах от 0 до 1). Таким образом, энергетический заряд клетки служит мерой ее обеспеченности высокоэнергетическими соединениями в расчете на общее число «аденозиновых единиц» (аденилатов). Величина его равна единице, когда весь аденилат представлен в форме АТР, и нулю, когда в клетке имеется только АМР. Для клеток в экспоненциальной фазе роста культуры эта величина обычно близка к 0,8.

Результаты проведенных исследований позволяют предполагать, что аллостерические ферменты активируются или ингибируются тем или иным аденилатом и что именно это обеспечивает согласованную регуляцию всего метаболизма клетки. Если, например, энергетический заряд клетки возрастает, то активность катаболических ферментов снижается, а активность ферментов, участвующих в процессах синтеза, увеличивается. При уменьшении энергетического заряда наблюдается обратная картина.