Общая микробиология - Шлегель Г. 1987
Регуляция метаболизма
Мутанты с нарушенной регуляцией
Выяснение механизмов, регулирующих биосинтез ферментов и их активность, стало возможным благодаря выделению мутантов с дефектами регуляции. Выделены мутанты нескольких типов, в том числе: 1) не образующие функционально полноценного репрессорного белка или содержащие его в сильно повышенном количестве; 2) с оператором конститутивного типа, который не способен связывать репрессорный белок; 3) с аллостерической нечувствительностью, у которых определенный фермент не может распознавать эффектор. Мы опишем некоторые методы, с помощью которых выделяют таких мутантов.
Мутанты, конститутивно образующие катаболические ферменты. Накопительные культуры такого рода мутантов можно получить путем частой смены субстратов. Если клетки конститутивно образуют ферменты, необходимые для использования субстрата А, то после переноса клеточной популяции с субстрата В на субстрат А они точас начинают расти с максимальной скоростью; клеткам же индуцибельного дикого типа для достижения максимальной скорости роста необходима определенная лаг-фаза (чтобы синтезировать ферменты для роста на субстрате А). После ряда генераций клетки снова переносят на среду с субстратом В и дают им расти до тех пор, пока ферменты, участвующие в использовании субстрата А, не будут достаточно сильно «разбавлены». После многократного повторения такой процедуры конститутивные мутанты сильно обгоняют в росте клетки дикого типа с индуцибельными ферментами. Таким путем были выделены, например, мутанты Е. coli, конститутивно образующие ферменты, необходимые для использования лактозы. В других методах отбора пользуются таким приемом, как подавление индукции при помощи структурных аналогов субстрата. Метилтиогалактозид может, например, подавить у Escherichia coli индукцию gаl-оперона, вызываемую галактозой.
Мутанты, конститутивно образующие анаболические ферменты. Эти мутанты, а также мутанты с нарушениями тонкой регуляции процессов биосинтеза могут быть выделены с помощью антиметаболитов. Многие антиметаболиты (разд. 6.6), будучи структурными аналогами нормальных конечных продуктов биосинтеза (аминокислот, пиримидинов и т.п.), оказывают бактериостатическое действие. Имитируя конечный продукт, они, с одной стороны, нарушают синтез нормальных метаболитов, а с другой - включаются в белки или нуклеиновые кислоты, в результате чего образуются макромолекулы, неспособные выполнять нормальные функции. Ингибирование таким «ложным» конечным продуктом приводит к остановке роста. Если на агаризованную среду с антиметаболитом высеять популяцию дикого типа (108-1010 клеток), то способность к росту и образованию колоний проявят только отдельные устойчивые мутанты.
В основе подобной устойчивости к антиметаболитам могут лежать разнообразные изменения физиологических свойств клетки, обусловленные мутациями. Рассмотрим типы таких мутаций.
1. Мутации, приводящие к «аллостерической нечувствительности». При такого рода мутации ни метаболит, ни антиметаболит не может подавить активность первого (аллостерического) фермента данного пути биосинтеза. В результате образование соответствующего конечного продукта не регулируется.
2. Мутации, приводящие к конститутивной дерепрессии. Следствие такой мутации-неконтролируемое образование ферментов, участвующих в синтезе конечного продукта.
3. Мутации, затрагивающие каталитические центры ферментов, активирующих метаболиты и участвующих в их превращениях. Вследствие повышения избирательности фермент может утратить способность связывать антиметаболит вместо метаболита. После этого антиметаболит уже не будет оказывать бактериостатического действия.
4. Мутации, приводящие к нарушению транспортных процессов. В результате таких мутаций антиметаболиты перестают поступать внутрь клетки и потому не могут уже влиять на ее метаболизм.
5. Мутации, обусловливающие конститутивное расщепление антиметаболитов. При этом клетка разрушает антиметаболит и тем самым обезвреживает его. С точки зрения отбора мутантов с нарушенной регуляцией интерес представляют только первые два типа мутаций. Дерепрессия синтеза анаболических ферментов и утрата способности подчиняться аллостерическому ингибированию часто приводит к «перепроизводству» и выделению в среду конечного продукта данного биосинтетического пути (метаболита). Для мутантной клетки это существенно потому, что метаболит вытесняет антиметаболит из реакции, обеспечивая таким образом рост клеток и образование колоний. Образующийся в избытке метаболит выделяется, диффундирует в агар и в зоне диффузии устраняет влияние антиметаболита на клетки дикого типа. Такие клетки начинают расти и образуют мелкие колонии; их называют вторичными или сателлитными колониями. Центральную же колонию образуют клетки мутанта, выделяющего метаболит (рис. 16.15). Рост сателлитов указывает на то, что произошла мутация, нарушившая нормальную работу регуляторных механизмов. Но для того, чтобы установить, какого рода дефектом обусловлено накопление и выделение метаболита, в каждом случае требуется специальный анализ.
С помощью метода, основанного на применении антиметаболитов, уже выделено много мутантов с дефектами регуляции. При сравнении различных мутантов выяснилось, что утрата механизма репрессии меньше влияет на скорость синтеза конечного продукта, чем изменение способности к аллостерическому ингибированию. У мутантов, не способных к ингибированию определенного пути биосинтеза, конечный продукт этого пути накапливается в клетке и часто выделяется в среду, несмотря на вполне нормальную репрессию. Напротив, у мутантов со значительной дерепрессией (конститутивностью) отмечается лишь очень небольшое накопление и выделение конечного продукта, если он оказывает нормальное ингибирующее действие. Таким образом, репрессия важна в первую очередь для уменьшения затрат, связанных с синтезом мРНК и белка, тогда как синтез метаболитов регулируется путем ингибирования конечным продуктом.
Рис. 16.15. Мутанты, устойчивые к одному из антиметаболитов. Вид чашки Петри, содержащей питательную агаризованную среду с антиметаболитом. Поверхность агара засеяна бактериями (около 109 клеток). Сначала выросли колонии только устойчивых мутантов. Ореолы вторичных колоний вокруг двух больших колоний показывают, что клетки последних выделяют метаболит.
Мутанты с измененной чувствительностью к эффектору. Мутантов, у которых изменена чувствительность какого-нибудь аллостерического фермента к эффектору, можно также выделять с помощью совершенно иного принципа, а именно как ревертантов к ауксотрофии. При этом поступают следующим образом. Сначала выделяют мутантов с дефектом регуляции, ауксотрофных в отношении метаболита, который хотят получить как конечный продукт, накапливающийся в среде. Затем среди этих ауксотрофных мутантов отбирают таких, у которых неспособность к синтезу данного метаболита обусловлена дефектом в аллостерическом ферменте соответствующего пути биосинтеза. После этого из полученной мутантной популяции выделяют прототрофных ревертантов, которые не нуждаются в этом конечном продукте, так как сами способны его синтезировать. Среди ревертантов отбирают тех, которые выделяют нужный продукт в среду. Их можно выявить биоавтографическим методом (разд. 10.2.2) или распознать по росту сателлитных колоний. О таком мутанте, полученном в результате двукратного отбора, можно составить себе следующее представление. У него после первой мутации перестал функционировать каталитический центр одного из аллостерических ферментов. Вторая мутация затронула структуру (конформацию) всей белковой молекулы, в результате чего каталитическая активность фермента восстановилась, но аллостерическая чувствительность оказалась утраченной. Как в этом, так и во многих других случаях для выделения желательного мутанта необходим ряд этапов, включающих мутагенез и отбор.
Теоретические и прикладные аспекты. Стратегия отбора мутантов весьма важна для дальнейшего изучения клеточного метаболизма и для выяснения механизмов регуляции. Вместе с тем эта стратегия имеет и практическое значение, так как именно она определяет пути целенаправленного отбора высокоактивных продуцентов всех тех веществ, которые могут быть получены с помощью микроорганизмов.